放射性核素示蹤技術在碳納米顆粒生物效應研究中的應用

諸 穎，冉鐵成，李晴暖，徐晶瑩，李文新

中國科學院 上海應用物理研究所 核分析技術重點實驗室，上海 201800

隨著納米科技持續迅速的發展，碳納米材料的生物效應受到愈來愈廣泛的關注。一方面，碳納米材料由于其進入細胞的高效率，有望用于構建藥物靶向輸運系統的載體[1-2]；另一方面，隨著碳納米管和納米碳黑的大量生產和應用，它們對環境和人類健康的潛在風險引起人們的擔憂，其安全性已經成為當前毒理學研究的另一熱點[3-4]。無論是作為藥物載體的研制、還是生物安全性的研究和評估，都需要了解碳納米材料如何與生命體系相互作用以及這種作用如何影響生命體系。而納米材料進入生命體系以及隨后在生命體內的吸收、分布、代謝、排泄則是研究兩者相互作用和產生相關生物效應的重要基礎。

與大多數化學分子或生物分子不同，目前缺乏可以用于碳納米顆粒本身檢測和分析的特異性反應，這成為研究碳納米材料與生命體系相互作用的障礙。由于放射性核素發射的射線有相當高的探測靈敏度，因此，將放射性核素標記碳納米顆粒、通過追蹤放射性的行跡就能探測到碳納米顆粒的位置和運動規律。放射性核素標記和示蹤技術，由于方法簡單、快速，結果直觀可信，尤其可以檢測復雜生物組織中的納米顆粒的特點，在生物醫藥領域得到愈來愈廣泛的應用。21世紀納米科技的迅猛發展又為放射性示蹤技術開辟了新的應用空間。本工作介紹了國內外放射性核素標記技術在碳納米材料與生命體系相互作用研究中的應用。通過這些介紹不僅可以了解納米材料與生命體系的相互作用及其科學意義，而且可以進一步認識到經典的放射化學技術在解決納米科技和生命科學這個新的交叉領域研究中起到的關鍵作用。

1 放射性示蹤技術研究碳納米顆粒的體內生物分布

1.1 富勒烯衍生物的體內生物分布

富勒烯家族的典型代表C60，是由60個碳原子組成的具有中空籠狀結構的球形分子，分子直徑為0.71 nm。C60的特殊結構賦予其許多奇異的生物活性，包括選擇性切割DNA、抗病毒、光動力學治療、清除自由基、抗氧化和抑制生物酶活性等。同時，C60分子含有30個雙鍵，具有高度的化學反應活性，可以連接上多種藥物分子成為新的C60-藥物偶聯物。由于藥物分子尺度增大、溶解特性改變以及C60基團本身的生物活性，使得這種新化合物有可能改進藥物靶向性、增加藥物生物利用度、降低藥物的毒副作用，從而增進藥物的治療效果。因此，C60作為藥物或藥物載體在醫藥領域有著廣泛的應用前景，C60衍生物的生物分布研究引起人們的極大興趣。

(1) 富勒烯衍生物在正常動物體內的生物分布

富勒烯最簡單的衍生物是富勒烯多羥基衍生物(富勒醇)和多羧酸衍生物，由于容易制取、水溶性高，因而受到特別的關注。Yamago[5]給小鼠口服14C標記的富勒烯羧酸衍生物，發現該衍生物只有少量被吸收，大部分隨糞便排出。采用靜脈注射方式給藥后，大部分標記物在1 h內被迅速輸送到各組織，48 h后90%聚集在肝中，很少有清除。注射一周后僅有2.4%標記物隨糞便排出體外，滯留在器官組織里的不足2%，其余標記物分布在肌肉和鼠毛里。標記物在體內滯留時間很長，并具有逾越血腦屏障的能力，但無急性中毒現象。Cagle[6]用籠內含放射性166Ho的C82多羥基富勒醇，166Hox@C82(OH)y，研究了它在大鼠體內的分布，結果表明，除了血液流量少的地方外，166Hox@C82(OH)y在全身都有分布，在肝中選擇性高度濃集，骨攝取居第二，清除均較慢，血池有不尋常的長時間殘留。注射4 h后，除腎、脾、骨、肝外，其余組織和器官攝取都顯著下降，腦中無攝取。標記物通過腎排泄，5天內排出20%完整的166Hox@C82(OH)y。

本研究組曾使用放射性核素99Tcm、125I 和67Ga標記了2種富勒烯多羥基衍生物，富勒醇C60(OH)x(x=22～24)和富勒醇環氧化物C60(OH)xOy(x+y=22～24)，研究了pH、濃度、溫度和時間等對標記率的影響以及標記物的穩定性[7-12]。小鼠靜脈注射后的生物分布結果指出，大部分標記物在1 h時被迅速輸送到除腦外的各器官組織中，標記物具有微粒樣的生物分布特征，容易富集在網狀內皮系統，主要分布在肝、脾、骨等部位。富勒烯多羥基衍生物容易發生團聚，實驗測定的粒徑約20 nm，這可能是具有微粒樣的生物分布特征的原因。此外，富勒醇在小鼠皮毛也有明顯的攝取，標記物主要通過腎臟從尿道排出。99Tcm標記的富勒醇在新西蘭大兔體內的單光子發射計算機斷層(SPECT)圖像顯示的體內分布特征與小鼠尸解和放射性測量結果基本相符[9]。上述實驗得到的生物分布資料為我們在富勒烯作為淋巴腫瘤靶向治療藥物和骨靶向藥物的新藥物設計和研究提供了實驗依據[13-14]。

(2) 富勒烯衍生物在荷瘤動物中的生物分布

在C60分子上連接臨床上使用的抗腫瘤藥物，新的C60-藥物偶聯物是否會由于C60基團本身的生物活性和結構效應帶來更好的抗腫瘤藥效是很有意義的研究課題。紫杉醇是臨床上常用的一線抗癌藥物，已有報道，C60-紫杉醇衍生物具有緩釋效果[19]，因而具有潛在應用價值，但是未見該化合物的體內分布和靶向性研究資料。淋巴道是癌細胞轉移的重要通道，及時進行針對淋巴系統的治療可以降低惡性腫瘤轉移幾率，減小外科手術切除范圍，為原發灶的治療爭取寶貴時間，對提高患者的治愈率、生存率和治療后的生活質量有重要意義。但是常規劑型的化療藥物沒有淋巴靶向性，如上文所述，C60具有微粒樣的生物分布特征，這使C60作為載體的抗癌藥物容易通過毛細淋巴管壁內皮細胞間隙和內皮細胞的胞飲進入淋巴系統，因而有望構建淋巴靶向給藥系統。經皮下或腔內注射以后，荷藥微粒順淋巴道移行，最后被載帶到淋巴結并較長時間在淋巴結濃集，從而達到抑制癌細胞轉移的目的。本研究組用臨床使用的惡性腫瘤化療藥物氮芥，成功合成了C60-苯甲醛氮芥。進一步通過有機合成和隨后的同位素交換反應得到苯環上標記有放射性核素125I的C60-苯甲醛氮芥[20]。將標記物行SD大鼠爪墊皮下注射。體內分布結果表明，C60-氮芥在胃和胃內容中的放射性攝取率最高，達60%ID/g；淋巴的攝取率也很高，約25%ID/g，僅次于胃，這提示該富勒烯衍生物有望用于胃癌治療，同時具有抑制癌細胞順淋巴道轉移的功效。細胞水平的藥效實驗表明，C60-氮芥對癌細胞的抑制作用小于氮芥，但在對大鼠原位胃癌模型的藥效分析實驗表明，C60-氮芥的抑瘤效果遠大于氮芥，兩者的抑瘤率分別為69.7%和33.6%。更有意義的是，C60-氮芥能有效抑制腫瘤細胞的腹膜轉移和淋巴結轉移，轉移率分別為0%和20%，明顯優于氮芥的40%和50%[13]。該實驗證明，C60-氮芥的更好藥效并不是源于化合物細胞毒性的增強，而是化合物對胃和淋巴系統的高靶向性，與臨床應用的氮芥相比，C60-氮芥可能是更有效且毒副作用更小的治療胃癌的新藥物。由此可見，放射性核素標記和示蹤技術在納米尺度靶向藥物的設計、研制和實驗驗證中起著重要作用。

1.2 碳納米管的體內生物分布

碳納米管是由碳原子形成的石墨烯片層圍繞中心按一定的螺旋角卷曲而成的無縫、中空的納米管。按納米管管壁層數分為單壁碳納米管(SWNTs)和多壁碳納米管(MWNTs)。在生物醫藥領域，碳納米管是非常有效的細胞內輸送藥物的載體，有望構建新一類藥物靶向輸運體系。為了開展藥物輸運系統的研究和碳納米管大量進入環境后的安全性評估，必須了解碳納米管在生命體內的生物分布和代謝行為。

(1) 碳納米管在正常小鼠體內的生物分布

自2002年北京大學王海芳等[21]首次用放射性核素標記和示蹤技術開啟了碳納米管在小鼠體內分布的研究以來，幾年中，納米管的生物分布已經積累了比較豐富的資料[21-25]。研究過的碳納米管有水溶性羥基化SWNTs[21, 23]，牛磺酸修飾的MWNTs[22, 24]和葡糖氨修飾的MWNTs[25]。使用的放射性核素有125I[21, 24]、14C[22]、131I[23]和99Tcm[25]。這些研究結果雖然存在一些差異，但總的生物分布特征基本一致。靜脈注射后，檢測時相從1 h[21]、10 min[22]縮短到僅2 min[23], 就觀察到納米管的體內分布，證明其可像小分子一樣在體內各組織和器官間自由穿梭，迅速遷移。除了腦以外，大部分器官都有攝取，最高的攝取發生在網狀內皮系統的肝和脾，此外，骨和肺也有較高的攝取。納米管通過腎臟從尿液排泄，但體內清除很慢，靜脈注射后90天，依然在肝和脾中能夠檢測到大量的納米管。靜脈注射、腹腔注射、灌胃、皮下注射等不同給藥途徑后，其生物分布無明顯差異。Tween-80非共價修飾的MWNTs能顯著降低網狀內皮系統對MWNTs的攝取。

英、法和意大利的聯合研究小組使用螯合分子二乙三氨五醋酸(DTPA)對長度為300～1 000 nm的SWNTs進行功能化修飾，然后將顯像核素111In連接在DTPA上，實現了化學修飾的水溶性SWNTs的放射性標記。實驗中，每只小鼠從尾靜脈注射200 μL含60 μg(111In)DTPA-SWNTs的PBS溶液[26]，但是，生物分布測定結果與文獻[21-25]有很大不同。標記物在網狀內皮系統的肝、脾等沒有明顯的攝取和滯留，有趣的是肌肉、毛和肺卻有異常的攝取。所有臟器和組織的放射性活度很快降低，血液清除很快，半衰期只有約3 h。標記物通過腎臟從尿液排出，且尿液中可以檢出完整的原形SWNTs。

由于納米顆粒的復雜性，有關生物效應的實驗研究結果缺乏可比性，彼此矛盾的結果也時有發生。對于碳納米顆粒體內生物分布的研究，今后應該給出有關納米管形貌、尺度、功能化修飾和疏水性等性質的詳細資料。要注意碳納米管在放射性核素標記以后可能發生的特性變化，同時，放射性標記物的體內穩定性對實驗測定的生物分布有非常重要的影響，一旦放射性核素從碳納米管上脫落，示蹤測量得到的是游離核素的生物分布，而不是碳納米管的生物分布。

(2) 碳納米管在荷瘤小鼠體內的生物分布

斯坦福大學的戴洪杰研究小組利用雙功能偶聯劑1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)將64Cu正電子核素連接在非共價修飾在SWNTs上的PEG上[27]。正電子發射計算機斷層(PET)技術指出，經PEG非共價修飾的SWNTs在小鼠體內相當穩定，血液清除時間較長且在肝、脾等內皮網狀系統有較高的攝取。在該納米管的PEG鏈上接上精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)小肽后能使納米管高效地靶向到小鼠皮下U87MG腫瘤，并且對生物體沒有明顯的毒副作用。對于分子量為5 400的PEG修飾的SWNTs，引入RGD，使腫瘤攝取從注入劑量的3%～4%增加到10%～15%；靶與非靶組織的攝取比增加到15。結果提示碳納米管有望作為腫瘤早期診斷藥物的載體。但是，腫瘤靶向治療藥物輸運系統的研制，還需要進一步研究抗腫瘤藥物在碳納米管上的負載、藥物在體內的釋放或緩釋以及納米管的最終去向和生物安全性等[28]。

2 放射性示蹤技術研究碳納米顆粒的體外細胞攝取和分布

細胞是構成生命體的基本單元，外界任何生物活性因子對機體的作用，均可通過細胞的形態與功能的改變表現并檢測出來。與動物模型相比，細胞模型具有較為簡單、易于控制實驗條件、實驗結果重復性較好等優點。因此，大量碳納米顆粒的生物效應研究都采用細胞模型進行。碳納米顆粒與細胞相互作用的初始階段就是納米顆粒被細胞內化而進入細胞。研究納米顆粒的細胞攝取及其在細胞內的分布是了解碳納米顆粒細胞生物效應的重要基礎。

放射性核素示蹤技術用于碳納米顆粒細胞攝取和分布的研究報道并不多見。2002年Foley等[29]研究了水溶性富勒烯的羧酸衍生物C61(CO2H)2與人纖維原細胞HS68的相互作用。使用熒光技術，證明了C61(CO2H)2穿越細胞膜進入細胞內；使用差速離心法收集各相應的細胞器組分，放射性計數結果表明該衍生物(14C-C61(CO2H)2)在線粒體分布最高，其次是細胞膜和微粒體，而細胞質液中最低。本研究組用125I和99Tcm分別標記了C60(OH)x，研究了標記物和L02細胞以及CHO細胞的相互作用，未發現這兩種細胞對C60(OH)x有明顯的攝取[30]。對于CHO細胞，細胞裂解液的放射性水平只有對照組的2～3倍，但依然可以看到，無血清細胞培養液中C60(OH)x的攝取率比有血清時的更高[30]。和C61(CO2H)2相比，C60(OH)x低的細胞攝取率可能起源于它們比C61(CO2H)2更高的水溶性，而血清蛋白通過和C60(OH)x相互作用進一步提高了后者的水溶性，導致更低的細胞攝取。

和水溶性富勒烯衍生物不同，碳納米管和納米碳黑(NCB)有非常高的細胞攝取[31]。本課題組用99Tcm成功標記了MWNTs和3種不同尺度的NCB[32]，定量檢測了人宮頸癌細胞Hela對這些顆粒的攝取量。實驗指出，碳納米顆粒濃度為100 mg/L時，MWNTs和NCB在完全培養液中的細胞攝取率為10%左右，當培養液中無血清時，細胞攝取率增加到約30%[31, 33]。根據存活的細胞數，攝取率轉換為每1 000個細胞對碳納米顆粒的攝取量。對于直徑分別為51、20、14 nm的3種NCB，每1 000個細胞攝取量分別為350、389、509 ng。可見，無血清條件下，細胞對3種不同尺度NCB的攝取具有明顯尺度效應，粒徑越小，攝取量越大，結果導致實驗檢測到的細胞毒性也越大[31, 33]。MWNTs的細胞攝取量與毒性關系不符合NCB的規律性，提示碳納米管的細胞毒性機制不同于NCB，可能由納米管制備時使用的金屬催化劑殘留所致[34-36]。實驗揭示的細胞攝取與血清和納米顆粒粒徑的依賴性對于深入理解碳納米顆粒與生物大分子的相互作用、納米顆粒的細胞內化過程以及內化機制具有重要科學意義；對于提高基因治療藥物的轉染率以及建立和規范碳納米顆粒細胞毒性檢測方法和評估標準等也有應用價值。由此可見，放射性核素示蹤技術能夠定量地描述碳納米顆粒的細胞攝取，預期這將在納米醫藥和納米毒理學領域的研究中發揮更重要、更廣泛的作用。

3 結論和展望

碳納米顆粒經過放射性核素標記可以便利地用于納米顆粒與生命體的相互作用研究，得到納米顆粒在生命體內的吸收、分布、代謝和排泄等重要資料。這些量化資料對于納米顆粒作為載體的藥物設計、藥效研究、納米材料安全性研究和毒性評估等都起著重要作用。隨著放射性核素成像的SPECT 和PET技術的迅速發展，特別是它們和CT 和MIR的圖像融合技術的建立和推廣，放射性核素標記和示蹤技術使納米顆粒在生命體內的行為和歸宿可以用醫學圖像顯示出來，這必將推動納米科技和生命科學的交叉領域研究的更快發展。

在細胞層次的研究中，盡管傳統的熒光標記和細胞成像已占有絕對優勢，但放射性示蹤技術在未來會有更大的發展空間。其中一個原因是熒光標記物的熒光信號不穩定，分析過程中容易淬滅，使定量分析的精確度欠高。然而，更重要的原因和碳納米顆粒本身固有的奇異性質密切相關。碳納米顆粒的奇異性質源于它們巨大的比表面以及由此帶來的高反應活性。放射性檢測的靈敏度高于熒光技術，標記在納米顆粒上的放射性只需要少數放射性原子或無機小分子。相反，熒光標記需要更多、更大的有機熒光分子，其結果將在更大程度上改變碳納米顆粒的表面性質，影響碳納米顆粒生物活性的研究。近年來一些實驗也證明，人們對熒光素干擾碳納米材料生物活性研究的擔憂不是沒有根據。

納米顆粒的放射性核素標記過程提出了不少屬于放射化學的問題，這本身對經典的放射化學也是一項新挑戰。14C的放射性標記中，核素是在碳納米材料合成時引進的，因此幾乎能夠完全保持碳納米材料原有的特性，但是這種標記技術只有少數實驗室能進行，且14C壽命很長，影響檢測的靈敏度。使用125I、131I和99Tcm等放射性核素在碳納米顆粒上的直接標記都存在機制不清楚的問題，目前尚不知道核素是以共價還是非共價方式和納米顆粒相結合，這也帶來對標記物的體內外穩定性、標記物在體內的放射化學純度等問題的擔憂。若使用偶聯劑對碳納米顆粒進行非直接標記，則標記位點和機制明確，且穩定性也會提高，但可能帶來標記后的納米顆粒是否還保留其本身特性的問題。因此，碳納米顆粒的放射性核素標記技術推動了碳納米顆粒生物效應的研究，反過來，也給經典的放射化學提出了更多的研究課題。隨著碳納米管和富勒烯研究和應用的進一步深入和推廣，以及碳納米家族新成員，石墨烯片、石墨烯帶和納米金剛石的出現，放射化學必將在與納米科技和納米生物學的交叉研究中得到進一步的充實和發展。

致謝：感謝本課題組李宇國和尹娟娟博士提供有用的資料和幫助。

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