抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY結構域對其轉錄、翻譯及亞細胞定位的影響

高波,段志堅,徐薇,熊思東

復旦大學免疫生物研究所,復旦大學上海醫學院免疫學系,上海200032

三結構域(tripartite motif,TRIM)蛋白家族均含有1個RING(really interesting new gene)結構域、1或2個B-box結構域和1個卷曲螺旋結構域(coiled-coil)。60%的TRIM蛋白在C端還有SPRY結構域[1]。TRIM家族蛋白與機體的多種生理功能有關,如細胞增殖、分化、發育、凋亡等[1,2]。尤為值得關注的是,近年研究發現多種TRIM家族蛋白在抗病毒免疫中起重要作用[3-7],提示TRIM家族蛋白是一類廣泛存在的、新型的抗病毒固有免疫分子[8,9]。TRIM22是干擾素誘導蛋白,多項研究表明它可有效抑制人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)的復制,是干擾素抑制HIV-1復制的關鍵效應分子[5,10,11]。另外,在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染猩猩的肝基因組學研究中發現,TRIM22與HBV及HCV的清除均有關[12],說明TRIM22亦可能在肝臟的抗病毒免疫中發揮作用。TRIM22的C端含有SPRY結構域。新近研究發現SPRY結構域在TRIM22的分子進化過程中起重要作用,并很可能與TRIM22對病毒的識別有關[13]。為研究SPRY結構域在TRIM22抗病毒免疫中的作用,本研究構建TRIM22的SPRY結構域缺失突變體,并對該突變體的功能進行初步研究。結果發現,SPRY結構域缺失突變體在轉錄及翻譯水平上與野生型并無差異,但它完全喪失了核定位能力。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人高分化的肝癌細胞系HepG2細胞株為本研究室保存。

1.2 試劑

真核表達質粒pcDNA3.1、TRIzol試劑購自Invitrogen公司。兩步法反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒為Fermentas公司產品。DNA聚合酶LaTaq、T4 DNA連接酶和限制性內切酶NheⅠ、HindⅢ均為TaKaRa公司產品。引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。膠回收試劑盒購自上海華舜公司。質粒提取使用Qiagen公司的質粒中量抽提試劑盒。鼠抗c-myc抗體(克隆號9E10)、鼠抗人GAPDH抗體及FITC標記的羊抗鼠IgG二抗均購自Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記羊抗鼠IgG抗體購自上海康成生物工程有限公司。硝酸纖維素膜和ECL化學發光試劑盒為Amersham公司產品。

1.3 帶Myc表位的TRIM22-ΔSPRY真核表達質粒的構建

以本實驗室先期構建的野生型TRIM22真核表達質粒[14]為模板,PCR擴增C端帶Myc表位的SPRY結構域缺失的TRIM22基因,上游引物:5′-CAGGCTAGCATGGATTTCTCAGTAAAGGTAGAC-3′(NheⅠ),下游引物:5′-CTGAAGCTTTCACAGGTCTTCTTCAGAGATCAGTTTCTGTTCA

GGTCAGTTAGCCTTGCCT-3′(HindⅢ),下劃線為酶切位點序列。對PCR產物和pcDNA3.1分別用NheⅠ和HindⅢ進行雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段,用T4 DNA連接酶在16 ℃將目的基因片段插入pcDNA3.1。連接產物轉化DH5α感受態細胞,挑取可疑陽性克隆,進行菌落PCR及雙酶切鑒定,并將陽性克隆送測序。

1.4 細胞培養及轉染

HepG2細胞在37 ℃、5% CO2條件下培養于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml鏈霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養基中。利用磷酸鈣沉淀法將目的質粒轉染對數生長期的HepG2細胞。轉染16 h后,用磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)洗2遍,然后加入新鮮培養基。

1.5 RT-PCR

收集HepG2細胞,用TRIzol試劑抽提細胞總RNA,并用DNaseⅠ處理1 h以清除殘余DNA。取總RNA 1 μg進行反轉錄。反應條件:72 ℃ 5 min,42 ℃ 60 min,72 ℃ 5 min。采用Oligo(dT)18引物進行反轉錄,獲得cDNA。PCR反應條件:94 ℃預變性4 min;94 ℃ 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30個循環;然后72 ℃ 10 min終止反應。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠成像儀上拍攝成像并進行灰度掃描。

1.6 蛋白質免疫印跡法

收集轉染后的HepG2細胞,置細胞裂解液中,經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離。電泳后,采用濕法(300 mA,90 min)轉移至硝酸纖維素膜。經封閉液(5%脫脂奶粉-TBST)封閉2 h后,分別加入1∶500稀釋的鼠抗c-myc單克隆抗體和1∶1 000稀釋的鼠抗人GAPDH單克隆抗體(用TBST稀釋),4 ℃過夜,漂洗3次,每次10 min。加入羊抗鼠IgG-HRP(TBST稀釋1∶500),室溫作用2 h,漂洗3次,每次10 min。用ECL化學發光法成像和顯影。

1.7 間接免疫熒光分析

將HepG2以1×106個/ml鋪于放有玻璃蓋片的6孔細胞培養板中,培養48 h后通過磷酸鈣沉淀法將TRIM22真核表達質粒轉染HepG2細胞。48 h后將玻璃蓋片取出,用4%中性甲醛固定30 min,PBS洗3次;0.2% Triton X-100冰上透化10 min,PBS洗3次;1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉1 h,PBS洗3次;與1∶500稀釋的鼠抗c-myc單克隆抗體4 ℃孵育過夜,PBS洗3次;與1∶1 000稀釋的FITC標記的羊抗鼠二抗室溫避光孵育2 h,PBS洗3次;與1∶500稀釋的DAPI避光作用10 min,PBS洗3次;甘油封片后鏡檢、拍照。

2 結果

2.1 TRIM22 SPRY結構域缺失突變體的構建與鑒定

為研究SPRY結構域在TRIM22抗病毒過程中的作用,以本實驗室先期構建的野生型TRIM22真核表達質粒為模板,PCR擴增C端帶Myc表位、SPRY結構域缺失的基因片段,再將其克隆入真核表達質粒pcDNA3.1中。SPRY結構域缺失突變體(ΔSPRY)的菌落PCR和酶切鑒定結果進一步證實缺失SPRY結構域的TRIM22真核表達質粒構建成功、讀碼框架正確無誤(圖1)。

A: Identification of plasmid expressing TRIM22-ΔSPRY by colony PCR. 1, DNA marker; 2, TRIM22-ΔSPRY PCR products; 3, negative control. B: Identification of plasmid expressing TRIM22-ΔSPRY by restrict endonuclease digestion. 1, DNA marker; 2, pcDNA/TRIM22-ΔSPRY digested withNheⅠandHindⅢ.

圖1TRIM22SPRY結構域突變體的構建與鑒定

Fig.1ConstructionofeukaryoticexpressionvectorforTRIM22-ΔSPRY

2.2 TRIM22的SPRY結構域對其轉錄的影響

為研究TRIM22的SPRY結構域對其轉錄的影響,將表達野生型TRIM22和SPRY結構域缺失的TRIM22真核表達質粒分別轉染HepG2細胞,轉染48 h后通過半定量RT-PCR檢測mRNA表達水平。結果發現,突變型TRIM22在轉錄水平上與野生型TRIM22沒有明顯差異(圖2)。

圖2TRIM22的SPRY結構域對其轉錄的影響

Fig.2TheeffectoftheTRIM22SPRYdomainonitstrans-cription

2.3 TRIM22的SPRY結構域對其翻譯的影響

為研究TRIM22的SPRY結構域對其翻譯的影響,將帶Myc表位的野生型和SPRY結構域缺失突變的TRIM22真核表達質粒轉染HepG2細胞,轉染48 h后利用抗Myc抗體進行蛋白質免疫印跡法檢測。在約55×103和33×103處分別檢測出野生型TRIM22和SPRY結構域缺失突變型TRIM22的表達,與預期的相對分子質量(Mr)相符,但兩者在蛋白表達水平上并無明顯差異(圖3)。

圖3TRIM22的SPRY結構域對其翻譯的影響

Fig.3TheeffectofTRIM22SPRYdomainonitstranslation

2.4 TRIM22的SPRY結構域對其亞細胞定位的影響

為研究SPRY結構域對TRIM22在HepG2細胞中亞細胞定位的影響,將帶Myc表位的野生型和SPRY結構域缺失突變的TRIM22真核表達質粒轉染HepG2細胞,然后利用抗Myc抗體進行免疫熒光定位。結果發現野生型TRIM22主要定位在HepG2細胞核中,與我們以前所報道的在COS-7細胞中的結果相符[14],而SPRY結構域缺失的TRIM22則彌散分布在細胞質中(圖4),提示SPRY結構域對TRIM22的亞細胞定位起關鍵作用。

A: Wild type TRIM22. B: SPRY domain deleted TRIM22.

圖4TRIM22的SPRY結構域對其亞細胞定位的影響(×400)

Fig.4TheeffectofTRIM22SPRYonitssubcellularlocalization(×400)

3 討論

TRIM蛋白屬于RING蛋白家族,迄今已發現近70個TRIM家族成員都含有相似的RBCC結構序列,從蛋白肽鏈的N端到C端依次包含1個RING結構域、1或2個B-box結構域和1個卷曲螺旋結構域。60%的TRIM家族分子C端還有1個SPRY結構域[1]。許多TRIM家族分子在抗病毒固有免疫中起重要作用,研究最為深入的是TRIM5α,具有廣泛的抗反轉錄病毒作用。恒河猴的TRIM5α分子可通過迅速降解病毒衣殼蛋白來抑制HIV-1的復制,從而抵抗HIV感染[3]。與TRIM5α在結構和功能上最為相似的是TRIM22。TRIM22基因的染色體定位于11p15,與TRIM5緊相鄰,兩者之間的距離僅為4.8 kb[15]。新近研究發現,TRIM22和TRIM5都表現出快速適應進化,即達爾文正向選擇(positive selection)的特點,但由于兩者具有極大的遺傳相似性,所以不能同時進行達爾文正向選擇[13]。多項研究表明,TRIM22亦可有效抑制HIV-1的復制,并與多種病毒感染有關,但TRIM22的抗病毒機制迄今還不清楚[5,10,11]。

60%的TRIM分子,包括TRIM22,在C端具有SPRY結構域。SPRY結構域的功能多樣,與細胞因子信號轉導的調節、RNA代謝及細胞內鈣離子的釋放等有關。在抗病毒免疫中,SPRY結構域可能與抗病毒特異性有關[16]。新近研究亦發現,TRIM5α和TRIM22分子進化的正選擇氨基酸位點均位于SPRY結構域,提示SPRY結構域可能與TRIM22對病毒的識別有關[13]。為研究SPRY結構域在TRIM22抗病毒過程中發揮的作用,本研究對TRIM22的SPRY結構域進行缺失突變。由于基因突變可能影響其表達水平,我們將SPRY結構域缺失突變型和野生型TRIM22真核表達質粒轉染HepG2細胞,然后比較其轉錄和翻譯表達水平。結果顯示,SPRY結構域的缺失并不影響TRIM22的轉錄和翻譯水平,這為后續研究中排除基因表達水平差異的影響以及研究SPRY結構域在TRIM22抗病毒過程中的作用奠定基礎。

研究表明多種TRIM分子以三聚體形式存在,TRIM蛋白的這種自我寡聚化能力有利于形成高Mr的復合物,從而構成顯著的亞細胞結構,存在于胞核或胞質中[1],而TRIM分子的亞細胞定位往往與其功能的發揮密切相關。我們前期的研究發現,TRIM22主要定位于細胞核中,與其作為轉錄因子的功能相符。為研究SPRY結構域在TRIM22的亞細胞定位中所起的作用,我們將SPRY結構域缺失突變型和野生型TRIM22真核表達質粒轉染HepG2細胞,利用免疫熒光技術進行亞細胞定位研究。結果發現,與定位在細胞核中的野生型TRIM22不同,SPRY結構域缺失突變體彌散分布在細胞質中,提示SPRY結構域對TRIM22的核內定位起關鍵作用,為進一步闡明該結構域在TRIM22抗病毒免疫中的作用和機制提供有益的啟示。

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