先天性巨結腸乳鼠模型的建立和評價

王玲朝 王春暉 江 遜 林 燕 王寶西

先天性巨結腸(hirschsprung＇s disease，HD)是病變結腸神經節細胞缺如的一種腸道發育畸形,其病因尚未闡明[1]，目前認為是遺傳及環境多種因素綜合所致[2]。HD發病率約為1/5 000，男∶女為4∶1。HD主要病理改變為病變結腸段神經節細胞缺如，病變結腸持續性痙攣、狹窄，近端腸腔擴張，內容物潴留。HD新生兒可表現為胎糞排出延遲和腸梗阻等癥狀，嬰兒及成人可表現為嚴重的便秘和腹脹，常合并小腸結腸炎、低位性腸梗阻，嚴重影響生活質量甚至危及生命[2～4]。

由于直接進行人體研究受到倫理學限制，Sato等[5]于1978年首先用苯扎氯銨(BAC)選擇性損毀鼠腸神經節細胞成功建立大鼠巨結腸模型，之后該模型被廣泛應用于損毀神經方面的研究。Yoneda等[6]于2002年用BAC建立了小鼠巨結腸模型。目前應用于HD研究的動物模型有花斑致死鼠和致死斑點鼠[7]，該模型與人類HD的病理學改變非常相似，但其培育困難，早期常死于嚴重的小腸結腸炎，存活時間短，不利于長期觀察研究。既往用BAC建立的大鼠和小鼠模型，是在大鼠和小鼠腸道神經系統已經發育健全的基礎上建立的，不符合HD的發病微環境。6～7日齡乳鼠腸道神經系統發育尚不健全且接近于胚胎時期[8]，用6～7日齡乳鼠建立的模型更接近于HD的發病微環境。本研究以乳鼠制備HD模型，并進行模型評價，為進一步深入研究HD及其相關并發癥的病因、病理機制、生理機制、病程演變特征及以Cajal間質細胞(ICC)為靶點治療HD奠定實驗基礎。

1 方法

1.1 動物和試劑 6～7日齡SD乳鼠9窩，每窩10只[由第四軍醫大學動物中心提供，生產許可證：SCXK(陜)2008-002]，乳鼠由母鼠喂養，母鼠采用二級鼠料喂養，動物飼養和實驗均遵照第四軍醫大學實驗動物飼養與使用規定。主要試劑：BAC(Sigma公司)；兔抗大鼠S-100蛋白多克隆抗體、兔抗大鼠NSE多克隆抗體、兔抗大鼠c-Kit多克隆抗體和羊抗兔FITC-IgG(均購自Boster公司)。

1.2 分組和HD模型建立 將9窩乳鼠從1～9編號，從隨機數字表第5行第8列開始依次讀取1位數作為隨機數，錄于編號下，將全部隨機數從小至大編序號，規定序號1～3為實驗組，4～6為對照組，7～9為正常組，各組均為3窩。實驗組術前將4～5日齡SD乳鼠在第四軍醫大學動物中心適應性飼養2 d。乙醚麻醉，在無菌條件下行下腹部正中切口，提取降結腸(圖1)，在其腸系膜的無血管區，將0.1%BAC溶液浸泡過的濾紙條(0.8 cm×1 cm)緊貼腸壁環形包繞結腸1周，每5 min滴加0.1%BAC溶液100 μL于濾紙上，保持濾紙濕潤。15 min后移去濾紙條，用溫生理鹽水棉球蘸洗結腸及腹腔，回納腸管，絲線縫合關腹。對照組用生理鹽水代替0.1%BAC溶液處理降結腸15 min，操作同實驗組。正常組不做任何處理。術后母鼠喂養，每籠1窩分籠飼養。

圖1 先天性巨結腸制備外觀模型

Fig 1 Hirschsprung's disease neonatal rat model

Notes Neonatal rat abdominal midline incision to show descending colon

1.3 模型評價 術后每周觀察乳鼠生活習性、飲食、排便情況及有無腹脹。術后1、3、5、6和7周每組任意取4只乳鼠處死，實驗組取BAC處理段結腸，對照組取生理鹽水處理段結腸，正常組取遠端結腸，生理鹽水沖洗腸腔，觀察各組結腸大體形態。

組織病理學檢查：各組結腸沿腸系膜緣縱行剪開，在濾紙上將腸壁展開，固定和編號。腸管用10%甲醛緩沖液固定24 h后取材。石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色。光鏡下觀察各組結腸神經節細胞的病理學改變。

免疫組化檢測：以SABC法檢測各組結腸神經節細胞S-100蛋白和神經細胞特異性烯醇化酶(NSE)表達。石蠟切片常規脫蠟至水，組織抗原微波修復(檸檬酸鹽修復液)正常羊血清封閉，滴加兔抗大鼠S-100蛋白多克隆抗體(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS液沖洗3次，每次2 min，滴加SABC試劑，37℃孵育20 min，PBS洗5 min，共4次，使用DAB顯色試劑盒，取1 mL蒸餾水，加入試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間為20 min，蒸餾水洗滌。用PBS代替一抗作陰性對照。NSE的檢測方法同S-100蛋白。

免疫熒光檢測：以c-Kit免疫熒光檢測各組結腸ICC的分布和表達。石蠟切片常規脫蠟至水，組織抗原微波修復(檸檬酸鹽修復液)正常羊血清封閉。滴加兔抗大鼠c-Kit多克隆抗體(1∶100)，37℃孵育1 h，PBS液沖洗3次，每次5 min。再滴加羊抗兔FITC-IgG(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS液沖洗3次，每次5 min。甘油封片，用PBS代替一抗作陰性對照，激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

2 結果

實驗組乳鼠死亡5只，其中術后1 h被母鼠啃食2只，術后1 d腸管被BAC腐蝕死亡1只，術后3 d感染死亡1只，7周后腸穿孔死亡1只。對照組乳鼠術后1 h被母鼠啃食1只。正常組乳鼠無死亡。

2.1 一般情況和大體結腸形態學觀察 術后1～3周實驗組和對照組乳鼠手術傷口愈合良好，吃奶及糞便正常，正常組未見異常表現。實驗組：術后4周3只出現腹脹；術后5周10只出現腹脹，排便減少，糞便顆粒性狀改變不明顯；術后6周12只出現腹脹，排便減少，較對照組和正常組糞便顆粒變大。

處死后大體解剖可見BAC處理段結腸狹窄。術后7周實驗組均出現不同程度的排便減少，腹脹，精神萎靡，消瘦，糞便顆粒較對照組和正常組干燥且明顯變大，處死后大體解剖可見BAC處理段結腸腸管狹窄、痙攣，無蠕動，病變近端腸管擴張，腸腔內容物潴留(圖2)。對照組和正常組結腸未見明顯異常。

圖2 實驗組術后7周大體解剖BAC處理段結腸所見

Fig 2 Autopsy of experimental rats 7 weeks after BAC treatment

Notes 7 weeks after BAC treatment，a narrowed segment at the site of BAC treatment，accompanied by distended proximal colon filled with massive feces

2.2 病理學檢查結果 正常組遠端結腸和對照組生理鹽水處理段結腸可見正常的肌間及黏膜下神經節細胞，正常組見圖3A。實驗組術后1、3周BAC處理段結腸肌間及黏膜下神經節細胞與對照組比較減少不明顯(圖3B,C)，術后5、6周可見神經節細胞數量逐漸減少、體積逐漸變小(圖3D,E)，術后7周神經節細胞完全消失，腸壁其他結構完整，未發現瘢痕形成及炎癥細胞浸潤(圖3F)。

圖3 正常組和實驗組結腸組織病理學檢查(蘇木精-伊紅染色，×100)

Fig 3 Pathology of normal and experimental group rats(HE，×100)

Notes A：Normal ganglion cells of the normal group；B：1 week after BAC treatment，ganglion cells had no significant changes；C：3 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased；D：5 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased in the number and the size；E：6 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased obviously in the number and the size；F： 7 weeks after BAC treatment，ganglion cells in the myenteric and submucous plexuses completely disappeared

2.3 S-100蛋白和NSE的表達 正常組遠端結腸和對照組生理鹽水處理段結腸S-100蛋白表達在神經節細胞的胞質和胞核中，兩組差異不明顯，正常組見圖4A。實驗組術后1、3周BAC處理段結腸肌間及黏膜下神經節細胞S-100蛋白的表達與對照組比較減少不明顯(圖4B,C)，術后5、6周神經節細胞S-100蛋白表達逐漸減少、神經節體積逐漸變小(圖4D,E)，術后7周S-100蛋白表達完全消失(圖4F)。

圖4 S-100蛋白在正常組和實驗組結腸組織的表達(免疫組化，×100)

Fig 4 The expression of S-100 protein in normal and experimental group rats(immunohistochemistry，×100)

Notes A：Normal ganglion cells appeared as brown particles in the normal group；B：1 week after BAC treatment，ganglion cells had no significant changes；C：3 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased；D：5 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased in the number and the size；E：6 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased obviously in the number and the size；F：7 weeks after BAC treatment，ganglion cells completely disappeared

正常組遠端結腸和對照組生理鹽水處理段結腸組織NSE表達在神經節細胞的胞核中，兩組表達差異不明顯,正常組見圖5A。實驗組術后1、3周BAC處理段結腸肌間及黏膜下神經節細胞NSE的表達與對照組比較無明顯改變(圖5B,C)，術后5、6周神經節細胞NSE表達逐漸減少、神經節細胞體積逐漸變小(圖5D,E)，術后7周神經節細胞NSE表達完全消失(圖5F)。

圖5 NSE在正常組和實驗組結腸組織的表達(免疫組化，×100)

Fig 5 The expression of NSE in normal and experimental group rats(immunohistochemistry，×100)

Notes A：Normal ganglion cells appeared as brown particles in the normal group；B：1 week after BAC treatment，ganglion cells had no significant changes；C：3 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased；D：5 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased in the number and the size；E：6 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased obviously in the number and the size；F：7 weeks after BAC treatment，ganglion cells completely disappeared

2.4 免疫熒光檢測c-Kit的表達 正常組遠端結腸和對照組處理段結腸ICC的分布和形態相似，差異不明顯，ICC在切面上幾乎呈現連續性分布，相互連接形成網絡狀結構，正常ICC多呈紡錘形，有2～3條突起，正常組ICC的分布和形態見圖6A。術后1周實驗組BAC處理段結腸c-Kit的表達與正常組較為接近(圖6B)，術后3、5、6和7周c-Kit的表達逐漸減少，提示ICC在BAC處理段結腸的分布明顯減少，ICC分布均較對照組和正常組明顯減少，網絡狀結構受到破壞，形態也出現異常，表現為突起變短、變鈍(圖6C～F)。

圖6 正常組和實驗組結腸組織c-Kit的表達(免疫熒光, ×200)

Fig 6 The expression of c-Kit in normal and experimental group rats(immunofluorescence，×200)

Notes A：Normal ICC of normal group； B：ICC 1 week after BAC treatment had no significant changes；C：ICC 3 weeks after BAC treatment decreased，D：ICC 5 weeks after BAC treatment decreased obviously，the network was disappeared；E：ICC 6 weeks after BAC treatment decreased obviously，the network was disappeared，and the configuration was abnormal；F：ICC 7 weeks after BAC treatment，decreased obviously，the network was disappeared，and the configuration was abnormal，the ICC got blunted and short processes

3 討論

研究發現，HD與ICC的減少有密切關系[9]。Rolle等[10]發現HD患者結腸腸管的肌間ICC比正常對照組顯著減少。王寶西等[11]研究發現ICC分布減少和形態異常可導致HD的發生。HD患兒由于病變結腸腸壁缺少神經節細胞使腸壁痙攣、腸腔狹窄，使糞便滯留在近端結腸，該段腸管繼發性擴張、肥厚，形成巨結腸。因此選擇性損毀結腸肌間及黏膜下神經節細胞是制備HD動物模型的理論依據。BAC選擇性損傷腸神經節細胞的機制可能是BAC長分子鏈與神經軸突膜活性基團多個位點結合并注入膜內，引起膜腫脹，離子自由進入膜內，進而引起膜的去極化，導致動作電位和靜息電位快速和不可逆地減小。當BAC作用于結腸壁時，膜電位比平滑肌細胞低的神經細胞易受到損傷，從而選擇性地損傷神經細胞，而不損傷其他細胞組織[12]。中國學者也用該方法成功地建立了成年動物HD模型[13～15]，但各研究中BAC濃度、作用時間、作用腸段長度，模型完成所需時間及所采用動物有所不同。本研究采用0.1%BAC作用在1 cm的乳鼠結腸段15 min，術后7周神經節細胞完全消失，提示模型建立成功。

在預實驗中術后乳鼠存活率僅為50%，多在術后3 d內死亡，主要原因為：人為的異味及血跡造成母鼠啃食乳鼠；手術不熟練致使乳鼠手術損傷加重；術后乳鼠對新環境不適應；術中和術后乳鼠體溫降低；清洗腹腔不徹底使BAC腐蝕乳鼠腹腔其他臟器；術后切口感染等。通過總結，采取術前乳鼠在飼養室適應1～2 d新環境；熟練手術步驟，做到快、準、輕和細，盡量減少對乳鼠的創傷；盡量減少BAC滲入腹腔；術中和術后加強對乳鼠保暖；術后給乳鼠體表涂抹適量母鼠尿液，覆蓋人為異味；術中嚴格無菌操作，術后切口涂適量青霉素粉劑預防感染等措施使乳鼠存活率明顯提高。

本研究發現ICC在實驗組和對照組的分布、數量和形態上均有差異。實驗組術后3～7周ICC的數量明顯減少，殘存ICC突起變短、變鈍，連續網絡結構破壞，與HD患兒結腸狹窄段神經節細胞和ICC改變的特點相一致[16]。ICC是一種特殊類型的間質細胞，廣泛分布于消化道，是胃腸慢波活動的起搏器和傳導細胞，也是腸神經作用的首要靶細胞[17]。ICC的基因表達產物c-Kit對于ICC表型的發育和維持是必需的，因此c-Kit成為胃腸道ICC的特異性標志物。可表達于ICC、肥大細胞及造血細胞等多種細胞[18]。在胃腸道組織中只有ICC和肥大細胞表達c-Kit，從而有較高的特異性[19]，c-Kit 受體被廣泛用于胃腸道ICC的鑒定[20]。肥大細胞數量很少，且其細胞形態很容易和ICC區分[21]，因此，本研究應用c-Kit特異性抗體和形態學的方法鑒定ICC，c-Kit表達減少，提示ICC的減少。

本研究用6～7日齡乳鼠成功建立HD模型，模型建立后實驗組乳鼠出現排便減少，腹脹，精神萎靡，消瘦，體重減輕，糞便顆粒變干和變大。大體解剖發現BAC處理段腸管狹窄、痙攣，無蠕動，病變近端腸管擴張，腸腔內容物潴留。NSE和S-100蛋白表達逐漸減少至消失，表明神經節細胞逐漸減少至消失，c-Kit的表達逐漸減少；提示模型建立成功。

本研究的不足之處和局限性：①技術方法不完善，未能使用免疫組化雙標及多標術使各組的神經節細胞、ICC共同顯色，以使結果更嚴謹和直觀；②未從分子生物學方面研究模型的特性。

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