結核菌素皮試和全血γ干擾素測定對兒童結核病診斷準確性的研究

孫 琳 肖 婧 李惠民 焦偉偉 馮衛星 吳喜榮 苗 青 焦安夏 郭雅潔 申阿東

結核感染是引起發展中國家兒童死亡的重要原因之一[1]。全世界每年約有100萬新發兒童結核病病例, 約有40萬兒童因此而死亡[2]。第4次全國結核病流行病學抽樣調查顯示，中國0～14歲兒童結核感染率為9.0%[3]。結核感染的早期診斷和治療是降低兒童結核病病死率的關鍵。因此，加強兒童結核感染的實驗室診斷，及早篩查出潛伏性結核感染者和活動性結核病，已成為當前控制結核菌感染的重中之重。

結核菌素(PPD)皮試是目前篩查兒童潛伏感染及診斷結核病的重要輔助手段，但由于純蛋白衍生物是多種抗原的混合物，所含抗原為致病性分枝桿菌、環境分枝桿菌及卡介苗(BCG)菌株所共有，其結果受到BCG接種及其他分枝桿菌感染的影響，?？蓪е录訇栃越Y果[4]。當患兒出現免疫功能低下，如結核性腦膜炎、全身播散性結核病時可出現假陰性結果。PPD皮試診斷結核病的特異度和敏感度還受其陽性判斷標準的影響，然而目前國內PPD皮試在兒童結核感染診斷中的標準尚不統一，在兒童結核感染診斷中仍存在一定的局限性。第4次全國結核病流行病學抽樣調查以硬結平均直徑≥6 mm或有水皰作為篩查成人和兒童潛伏結核感染的標準。中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的“兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案(試行)”[5]認為PPD皮試硬結直徑﹥15 mm多見于結核桿菌自然感染，而因BCG接種引起的很少見。

全血IFN-γ測定以結核分枝桿菌特異性抗原早期分泌靶蛋白ESAT-6(early-secreted antigenic target-6) 和培養濾液蛋白(culture filtrate protein-10)，刺激活化T細胞產生IFN-γ為原理建立。一方面，該試驗結果不受BCG接種的影響，因此尤其適用于BCG接種率較高的人群[6]，具有較高的敏感度(75%～97%)和特異度(﹥95%)[7]。全血IFN-γ測定已在歐美等國廣泛應用于結核病的常規診斷和療效評估[8～10]。另一方面，該試驗受機體免疫狀態的影響較小，只有當患者的CD4+T細胞數每微升﹤100時，其敏感度才會有所降低[11]，因此在結核和HIV雙重感染或免疫抑制人群[12，13]、免疫力較低的嬰幼兒和兒童[14]中也有較好的應用價值。孟成艷等[15]研究認為全血IFN-γ測定輔助診斷疑似結核病患者，具有較高的診斷價值。樂軍等[16]研究表明，全血IFN-γ測定在快速診斷結核感染中具有較高的敏感度和特異度。

然而，目前關于全血IFN-γ測定在結核感染患兒中診斷價值的研究較少，特別是在結核病高發、BCG接種率較高中國的數據更為缺乏，同時基于目前國內PPD皮試在兒童結核感染診斷中的標準尚不統一，本研究試圖通過不同結核病實驗室診斷方法的比較，尋求適合中國國情的、經濟的和高效的實驗室診斷方案，為兒科臨床結核感染的診斷提供依據。

1 方法

1.1 研究設計 2006年7月前瞻性地設計了PPD皮試不同陽性判斷標準、PPD皮試和全血IFN-γ測定對結核病診斷的準確性研究，并參照文獻[17,18]，以年齡(<3歲和≥3歲)、居住地(城區和郊區)、BCG接種史作為本研究診斷性試驗的影響因素，觀察上述影響因素對PPD皮試和全血IFN-γ診斷結核病的敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值和似然比等[19]。

1.2 納入標準 首都醫科大學附屬北京兒童醫院2個呼吸科病房以結核病和呼吸系統疾病住院的所有患兒為觀察對象，2個呼吸科病房的醫生均了解本研究的設計和實施要求。PPD皮試在取得患兒及其監護人同意的情況下為2個呼吸科病房住院患兒的常規檢查，由于全血IFN-γ測定為有創性檢查，在2個呼吸科病房的醫生盡可能詳細說明本研究的目的和免費全血IFN-γ測定的前提下、在患兒及其監護人在理解本研究目的的情況下，自愿參與本研究者，作為數據收集的基本要求。存在呼吸系統疾病同時伴有肺外感染或自身免疫性疾病或內分泌系統疾病或HIV感染的患兒不建議行全血IFN-γ測定。在結束本研究觀察的時點后，通過查閱病史，能提取本研究計劃觀察項目的病例，如入院年齡、有明確的PPD直徑數值(不僅以陽性或陰性表示者)、BCG接種史明確者作為本研究的納入對象。

1.3 排除標準 符合以下任一項者被排除：①行PPD皮試和全血IFN-γ測定前使用糖皮質激素及其他免疫抑制劑患兒的數據；②本次入院前已接受抗結核治療1個月以上，盡管也進行了PPD皮試和全血IFN-γ測定的病例也被排除。

1.4 分組設計 根據患兒所暴露的危險因素分為5組：A組：無結核病密切接觸史的非結核病的呼吸系統疾病患兒；B組：有活動性結核病患者密切接觸史的非結核病的呼吸系統疾病患兒；C組：無結核病密切接觸史的臨床診斷結核病患兒；D組：有活動性結核病患者密切接觸史的臨床診斷結核病患兒；E組：病原學或病理學確診的活動性結核病患兒。

1.5 診斷標準 結核病的診斷依據美國胸科協會制定的“成人和兒童結核病診斷和分級標準”[20]和中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的“兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案(試行)”[5]。其中具有典型的臨床癥狀和影像學證據，同時存在病原學檢測或組織病理學檢測陽性者，為確診病例(E組)；具有典型的臨床癥狀和影像學證據，同時具有以下4項中任意2項者即為臨床診斷病例(C、D組)：①活動性結核病接觸史；②PPD皮試陽性；③抗結核治療有效；④排除其他肺部疾病。

潛伏結核感染診斷標準參照《實用小兒結核病學》[21]，選取PPD皮試陽性除外BCG接種后反應,無影像學或臨床無活動性結核病證據，可能A、B組病例存在潛伏結核感染。

1.6 倫理 本研究取得了首都醫科大學附屬北京兒童醫院倫理委員會的批準。

1.7 PPD皮試方法 患兒于入院當天，前臂皮下注射0.1 mL(含5 U的PPD),注射后48～72 h測量硬結大小。記錄硬結平均直徑=(橫徑+ 縱徑) /2 ,反應大小以mm記錄。

1.8 PPD皮試陽性結果標準 無硬結或硬結平均直徑<5 mm為陰性;～10 mm為陽性；～20 mm為中度陽性；≥20 mm為強陽性；局部除硬結外還有水泡、破潰、淋巴管炎及雙圈反應為極強陽性。

1.9 全血IFN-γ測定

1.9.1 血樣采集 患兒于入院后1～7 d內采集外周靜脈血2 mL，肝素抗凝，標本采集后室溫放置，并于6 h內進行測定。

1.9.2 外周血單核細胞(PBMC)的分離和培養 用無菌Ficoll液分離PBMC，加入細胞培養液AIM-V重懸細胞。吸取10 μL預溫培養液進行活細胞計數，將培養液的PBMCs濃度調整到每毫升2.5 ×105個。T細胞酶聯免疫斑點法(TSPOT)-TB試劑盒(英國Oxford Immunotec Ltd)中預包被抗IFN-γ抗體的96孔微孔板設陰性對照孔,陽性對照孔(A和B檢測孔)，分別加入50 μL AIM-V細胞培養液，植物血凝素,結核菌特異抗原ESAT-6和CFP-10。將分離的PBMC懸液加入各孔中，每孔100 μL。將微孔板置于37℃ 5%CO2孵箱16～20 h后，用PBS洗板4次，加入堿性磷酸酶標記的小鼠抗人IFN-γ單抗，4℃溫育1 h。PBS洗板4次。加入50 μL底物顯色溶液至所有孔中。室溫孵育7 min。用蒸餾水充分洗滌孔的內部終止反應。

1.9.3 PBMC 釋放IFN-γ檢測和結果判斷 以放大鏡或計算機輔助成像分析系統進行斑點計數。

TSPOT-TB陽性標準：陰性對照孔斑點數為0～5個,任何一個檢測孔計數減去陰性孔計數≥6判斷為陽性。如陰性對照斑點數≥6,檢測孔斑點數≥2倍陰性對照孔斑點數,也判定為陽性(圖1)。

圖1 全血IFN-γ測定陰性和陽性結果

Fig 1 The negative and positive results of whole blood IFN-γ assay using TSPOT-TB

1.10 統計學方法 計數資料以百分比表示，率的顯著性采用χ2檢驗。PPD皮試和全血IFN-γ測定陽性率與結核感染暴露程度的相關性采用等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。采用SPSS 11.5軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 一般資料 本研究從2006年7月開始收集病例，研究截止時間為2010年3月。在首都醫科大學附屬北京兒童醫院2個呼吸科病房4 400例結核病和呼吸疾病患兒中，由于絕大部分患兒及其監護人不同意行免費全血IFN-γ測定，致使符合納入和排除標準的患兒僅有125例。A組40例、B組11例、C組29例、D組27例和E組18例進入分析,各組一般資料見表1。E組病原學確診6/18例(33.3%)，病理學診斷12/18例(66.7%)；C～E組共計74例患兒中，15例(20.3%)有發熱、盜汗、納差和消瘦等結核病中毒癥狀，24例(32.4%)有結核病密切接觸史；53例(71.6%)有BCG接種史。BCG接種率由A組至E組逐漸降低。

表1 各組研究對象的一般資料

Notes M/F:Male/Female

2.2 兩種方法診斷結核病的準確性 各組患兒PPD皮試和全血IFN-γ測定陽性結果見表。A組28/40例(70.0%)PPD皮試硬結<4 mm，2例(5.0%)全血IFN-γ測定陽性且PPD皮試硬結≥15 mm；B組6/11例(54.5%)PPD皮試硬結<4 mm，1例全血IFN-γ測定陽性且PPD皮試硬結≥15 mm。C～E組20/74例(27.0%)PPD皮試硬結在10～14 mm，PPD皮試硬結<15 mm的37例患兒中15例為全血IFN-γ測定陽性。

如表3所示，隨著PPD皮試陽性判斷標準逐漸升高，PPD皮試診斷活動性結核病的敏感度逐漸降低，陰性預測值逐漸減小，特異度逐漸升高。取硬結≥10 mm為陽性判斷標準時的敏感度為77.0%，可用于結核病診斷；取硬結≥15 mm為陽性判斷標準時的特異度為88.2%，可用于結核篩查。

全血IFN-γ測定敏感度為85.1%，特異度為94.1%，均高于PPD皮試，提示在診斷活動性結核病和篩查潛伏結核感染者中均具有較好的診斷價值。

表2 各組患兒PPD皮試和全血IFN-γ測定陽性結果[n(%)]

表3 PPD皮試和全血IFN-γ測定診斷結核病的準確性

Tab 3 The indexes of PPD test and whole blood IFN-γ assay in diagnosis of pediatric TB

TestSen/%Spe/%PPV/%NPV/%LRSizeofindurationofPPDtest/mm ≥5(n=78)82．466．778．272．32．5 ≥10(n=72)77．070．679．267．92．6 ≥15(n=43)50．088．286．054．94．2 ≥20(n=21)27．098．095．248．113．5IFN?γassay(n=125)85．194．195．581．414．4

Notes Sen:sensitivity;Spe:specificity;PPV:positive predictive value;NPV:negative predictive value;LR:likelihood ratio

2.3 兩種方法敏感度和特異度影響因素的分析 分別計算PPD皮試(硬結≥10 mm為陽性判斷標準)和全血IFN-γ測定在不同年齡(<3歲和≥3歲)、居住地(城區和郊區)和BCG接種史(無和有)時診斷結核病的敏感度和特異度。結果顯示，<3歲患兒PPD皮試的敏感度和特異度均顯著低于≥3歲患兒(P=0.001，P=0.037)；在未接種BCG的2例非結核病患兒中1例為PPD陰性，故PPD皮試的特異度為50%；居住地對PPD皮試的敏感度和特異度無顯著影響。全血IFN-γ測定的敏感度和特異度在不同年齡、居住地和BCG接種史間差異均無統計學意義(表4)。

表4 PPD皮試和全血IFN-γ測定診斷結核病敏感度和特異度影響因素的分析

Tab 4 Evaluation of the effect of influencing factors of PPD test and whole blood IFN -γ assay in diagnosis of pediatric TB

FactorPPDtestSen/%Spe/%wholebloodIFN?γassaySen/%Spe/%Age/years<3(n=32)67．925．071．4100≥3(n=93)95．774．587．093．6AreaCountry(n=78)91．281．080．7100．0Town(n=47)88．276．782．490．0BCGvaccinationYes(n=102)88．771．481．193．9No(n=23)76．250．081．0100．0

Notes Sen:sensitivity;Spe:specificity

2.4 兩種方法陽性率與結核菌感染暴露因素的相關性 以PPD皮試取≥10 mm為陽性判斷標準時，PPD皮試陽性率與結核感染暴露因素的等級相關系數為0.425，P=0.000；當PPD皮試取≥15 mm為陽性判斷標準時，PPD皮試陽性率與結核感染暴露因素的等級相關系數為0.256，P=0.004。全血IFN-γ測定陽性率與結核感染暴露因素的等級相關系數為0.676(P=0.000)，相關性高于PPD皮試。

3 討論

本研究從2006年7月至2010年4月2個呼吸科病房住院的4 400例患兒中，由于排除了絕大部分患兒及其監護人不同意行全血IFN-γ測定的病例，致使4年來本研究僅納入125例患兒。病原學檢查作為目前結核病診斷的金標準。但由于患兒痰標本不易獲取且常合并肺外結核感染，因此本研究中PPD皮試和全血IFN-γ測定的敏感度評價以最終確診和臨床診斷為活動性結核病為金標準；特異度評價在A和B組患兒中進行。基于目前國內PPD皮試在兒童結核感染診斷中的標準尚不統一，本研究同時評價了不同陽性判斷標準對PPD皮試診斷價值的影響。

BCG接種是中國兒童常規免疫接種項目，但對于其在預防結核病的作用結論不一致。BCG抗結核分枝桿菌感染的作用在0～80%，且易引起BCG播散性疾病，美國等國家也相繼取消了新生兒的BCG常規接種。本研究發現，結核病患兒中BCG接種率明顯低于非結核感染呼吸系統疾病患兒(表1)，結果提示BCG對中國兒童抗結核分枝桿菌感染有一定的作用。

本研究顯示，隨著PPD皮試陽性判斷標準逐漸升高，特別是當PPD皮試以硬結≥15 mm為陽性判斷標準時，其敏感度明顯降低。PPD皮試在C～E組患兒中出現假陰性結果，增加了漏診率。分析原因，發現在C～E組的74例患兒中，15例(20.3%)為全血IFN-γ測定陽性而PPD皮試陰性，20例(27.0%)PPD皮試硬結在10～14 mm，考慮C～E組患兒出現較重的結核病癥狀時，如結核性腦膜炎等，由于機體免疫狀態降低而導致遲發型免疫反應減弱。因此，本研究提示在結核病患兒以PPD皮試硬結≥10 mm為診斷標準，可提高診斷的敏感度,可能會減少機體免疫狀態對結果的影響。

本研究結果顯示，PPD皮試篩查潛伏結核感染時，以硬結≥10 mm作為診斷標準其特異度較低?？紤]是由于BCG接種[17]或非結核分枝桿菌感染[22]導致的假陽性結果有關。A和B組PPD皮試陽性率分別為25.0%(10/40例)和45.5%(5/11例)，遠高于中國兒童潛伏結核感染率(4.6%～14.4%)，同時兩組患兒BCG接種率分別為97.5%和90.9%。該結果提示，較高的PPD皮試陽性率可能是由于PPD與BCG的交叉反應而導致的假陽性結果。A和B組全血IFN-γ測定陽性率分別為5.0%(2/40例)和9.1%(1/11例)，提示該方法受BCG接種的影響較小，具有較高的特異度[23]。目前對于非結核分枝桿菌感染所致PPD皮試陽性的研究結果尚不統一。Bahrmand等[24]和von Reyn等[25]認為非結核分枝桿菌感染導致的PPD皮試硬結一般在5～14 mm；而Haimi-Cohen[22]等認為50%非結核分枝桿菌感染患兒的PPD皮試硬結﹥15 mm。

為進一步排除BCG接種和非結核分枝桿菌對PPD皮試結果的影響，本研究分析了PPD皮試硬結≥15 mm作為篩查結核感染的價值，結果顯示，A和B組PPD試驗陽性率分別為12.5%(5/40例)和9.1%(1/11例)，該結果與中國兒童潛伏結核感染率較為一致，PPD皮試的特異度增加。提示，以PPD皮試硬結≥15 mm為陽性判斷標準，可提高診斷的特異度，避免BCG和非結核分枝桿菌感染的干擾。在非結核呼吸系統疾病的A和B組患兒中，有3例患兒全血IFN-γ測定陽性且PPD皮試硬結≥15 mm，其中僅1例具有活動性結核病患者接觸史，考慮其為潛伏結核感染患兒。但由于目前尚無潛伏結核感染診斷的金標準，該結果尚需進一步的驗證。

多項研究指出，BCG接種可影響PPD皮試診斷結核病的準確性，可使特異度降低。本研究雖顯示相反的結論，但由于病例數較少，需擴大樣本量進一步分析。機體的免疫狀態也是影響PPD皮試診斷準確性的重要因素，由于兒童的免疫功能尚不健全，且隨年齡增長而改變，3歲前后機體的T細胞亞群存在差異(相關數據另文發表)，因此本研究分析了年齡因素對PPD皮試和全血IFN-γ測定診斷準確性的影響。結果顯示，<3歲患兒PPD皮試診斷結核病的敏感度和特異度顯著低于≥3歲患兒，究其原因可能為<3歲患兒免疫系統尚不完善，且BCG接種導致的機體記憶性保護作用仍較強。由于當前結核感染率仍存在城鄉差異，但本研究未發現城鄉因素對兩種試驗準確性產生影響，可能考慮與本研究納入的125例患兒郊區與城區樣本量間有較大差異有關。

本研究同時對兩種方法的陽性率與結核感染暴露因素的相關性進行研究，結果顯示，PPD皮試和全血IFN-γ測定均與結核感染暴露因素呈正相關，但全血IFN-γ測定相關程度高于PPD皮試，提示全血IFN-γ測定試驗具有更好的診斷價值。

全血IFN-γ測定診斷結核病雖具有較高的敏感度和特異度，但其仍存在操作技術要求高、費用昂貴等因素，限制了其在中國兒童中的廣泛應用。因此，考慮在以下情況下可將全血IFN-γ測定作為PPD皮試初篩后的輔助診斷工具應用于臨床診斷：①疑似結核病患兒PPD試驗結果陰性；②患兒無結核病接觸史等危險因素存在前提下，PPD皮試陽性無法除外潛伏性結核感染；③當患兒PPD皮試硬結在10～14 mm；④患兒年齡<3歲。

總之，全血IFN-γ測定是當前結核感染篩查和診斷的重要輔助手段，可有效彌補PPD皮試在BCG接種率高、結核病負擔重的國家或地區應用的局限性。

本研究的不足之處和局限性：①由于兒童結核病病原學診斷較為困難，C和D組為臨床診斷病例，缺乏病原學金標準；②因倫理原因，本研究對照組選取的呼吸科病房住院的呼吸系統疾病患兒，未設健康兒童對照組；③部分結核病患兒為接受抗結核治療1～7 d后進行的全血IFN-γ測定，但有研究表明抗結核治療1個月內，全血IFN-γ測定陽性率下降較前無統計學意義[26]；④由于本研究納入病例有限，且診斷準確性影響因素(年齡、居住地和BCG接種史)的各組患兒病例數不均衡，可能會對結果產生一定影響。

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