13-順維甲酸體外誘導神經母細胞瘤干細胞分化的體外實驗

劉秋霞 蔡嬌陽 李本尚 湯靜燕

神經母細胞瘤(NB)是起源于神經嵴的兒童外周神經系統腫瘤，占兒童實體瘤的8%～10%。隨著化療方案的改進及綜合治療的開展，許多兒童腫瘤的預后明顯改善，但NB患兒的預后沒有顯著提高，特別是晚期患兒的轉移率、復發率較高，長期生存率不到40%[1]。腫瘤干細胞(TSC)假說認為，腫瘤組織中存在一群與干細胞有相似特性的細胞，稱為TSC[2]；這群細胞具有無限增殖和多向分化的能力，決定了腫瘤的發生和演變。TSC與腫瘤的發生、轉移、復發和耐藥都有密切的聯系。可以推測晚期NB患兒中的TSC是其預后較差的原因之一。已有實驗證實，正常神經干細胞在添加生長因子的無血清培養基中，能分裂增殖為多細胞克隆球，形成三維球狀結構的神經球，此神經球中富集干細胞和祖細胞[3]。Hansford等[4]報道無血清培養原代NB細胞形成的神經球具有干細胞特性，10個成球細胞就可以使非肥胖型糖尿病/重度聯合免疫缺損(NOD/SCID)小鼠成瘤。本研究通過體外觀察和鑒定13-順維甲酸對NB干細胞的誘導分化作用，為臨床應用13-順維甲酸治療NB微小殘留病灶提供了實驗依據。

1 方法

1.1 材料 DMEM /F12培養基、B27和0.25%胰酶購于GIBCO公司；人表皮生長因子(EGF)和人堿性成纖維生長因子(bFGF)購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購于Promega公司；Ex-TaqPCR試劑盒購于TaKaRa公司；Poly-D-Lysine和13-順維甲酸購于Sigma公司；鼠抗人nestin 單克隆抗體購于ABcam公司；Cy3標記羊抗鼠IgG二抗購自Jackson Immunoresearch Laboratories公司。

1.2 神經球的培養、分離純化及誘導分化 共收集到14例伴骨髓轉移(骨髓涂片可見成團的腫瘤細胞，流式分析CD56+CD81+CD45-的細胞為NB細胞)的Ⅳ期NB患兒的骨髓液標本，各取骨髓液3 mL，用Ficoll分離液分離出的單個核細胞置入25 cm2培養瓶中，重懸于無血清培養基(DMEM/F12培養基，含20 μmol·L-1EGF、20 μmol·L-1bFGF和2%B27)，調整細胞濃度為1×105·mL-1，于37℃、5%CO2和飽和濕度的條件下培養。每3 d向培養瓶中滴加新鮮無血清培養基，采用機械法輕輕打散細胞，每7 d按1∶3比例傳代1次。

為了解最適合的13-順維甲酸濃度和分化時間，本研究以不同濃度13-順維甲酸和誘導時間進行預實驗。簡述如下：6孔板中分別添加0.1 、0.5、1、5、10和20 μmol·L-1的13-順維甲酸，分別在0、3、6、9、12 和15 d觀察細胞生長情況，發現含10 及20 μmol·L-113-順維甲酸的細胞很快死亡，而0.1、0.5、1和5 μmol·L-113-順維甲酸的細胞隨誘導時間的延長，漸分化，以5 μmol·L-1最顯著，含5 μmol·L-113-順維甲酸的細胞誘導至9 d后，細胞顆粒逐漸增多，12～15 d細胞逐漸死亡。根據預實驗結果，選擇5 μmol·L-113-順維甲酸，以3及9 d作為誘導分化觀察時間點進行研究。

用400目的篩網輕輕過濾含有神經球的培養液，收集未濾過篩網的神經球，機械法打散神經球細胞后，在含10%FBS的DMEM/F12血清培養基中培養過夜，細胞貼壁后，次日添加5 μmol·L-113-順維甲酸(DEMO溶解，DEMO終濃度<1‰)，每3 d胰酶消化和傳代，并添加5 μmol·L-113-順維甲酸。

1.3 RT-PCR法檢測神經球細胞Oct-4的表達 Trizol法分別提取未經誘導、誘導3和9 d的3組NB神經球細胞的總RNA。RNA經濃度測定和電泳質檢后，按照Promega反轉錄試劑盒要求進行反轉錄得到cDNA。然后，PCR檢測干細胞特異表達基因Oct-4表達水平，以GAPDH為內參。

目的基因Oct-4的引物序列為：

正向 5′-GACAACAATGAAAATCTTCAGGAGA-3′；

反向5′-TTCTGGCGCCGGTTACAGAACCA-3′；

片段長度為218 bp。

內參GAPDH的引物序列為：

正向5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′；

反向5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′；

片段長度為99 bp。

PCR反應體系為20 μL，其中模板cDNA 1 μL；Ex Taq 酶0.125 μL；10×Ex Taq buffer 2 μL；dNTP mixture 2 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；滅菌蒸餾水補足至20 μL。將PCR管放入Eppendorf PCR儀，設定反應條件：94℃ 5 min；然后94℃ 30 s，退火溫度 30 s，72℃ 30 s循環，Oct-4、GAPDH的退火溫度分別為50℃和56℃，Oct-4循環30次，GAPDH循環25次；最后72℃延長2 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，比較誘導后神經球細胞Oct-4的表達變化。

1.4 細胞免疫熒光檢測誘導前后巢蛋白(nestin)的表達變化 將未經誘導分化的神經球細胞和5 μmol·L-113-順維甲酸誘導9 d的細胞，置入1%FBS的DMEM/F12培養基中，濃度調整為1×105·mL-1，將Poly-D-Lysine處理過的無菌蓋玻片放入24孔板，分別滴加兩組細胞各2 mL，8 h后細胞貼壁，無菌鑷子取出蓋玻片。

將蓋玻片分別用冰冷的3.7%的多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后用含0.1%Triton X-100的PBS溶液破膜30 min；5%BSA室溫封閉1 h，加nestin一抗(1∶200)，室溫孵育2 h；然后用PBS洗滌5次，每次5 min；室溫下再次用5%BSA封閉1 h，隨后加入Cy3標記二抗(1∶2 000)，室溫避光結合30 min；最后，DAPI(1∶1 000)避光染核10 min。PBS清洗3次，每次5 min。待蓋玻片自然干燥后，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。設不加一抗組作為陰性對照。

2 結果

2.1 NB神經球的培養及誘導分化 14例骨髓液標本中，4例分離到原代NB細胞，在無血清培養基中培養4～6 d后，可見懸浮神經球形成，傳代后，成球細胞能再次分裂增殖為神經球，其中2例連續穩定傳代(骨髓中腫瘤細胞>90%)，另外2例在不斷傳代中逐漸貼壁、分化。

神經球細胞在血清培養基中開始貼壁生長，呈三角形或星形，細胞突起鈍且短(圖1A)；添加5 μmol·L-113-順維甲酸誘導后，細胞的生長速度降低，形態發生了明顯的變化，細胞突起增多和變長，逐漸連接成網(圖1B～D)。

圖1 NB神經球的培養及誘導分化

Fig 1 The culture and differentiation of neurosphere cells

Notes A：Neuroblastoma cells from bone marrow aspirates formed nonadherent spheres after growing in serum-free stem cell conditions for 4-6 days；B,C,D：The morphology of neurosphere cells before induction, 3 days and 9 days after induction respectively. Neurosphere cells were cultured in differentiation medium supplemented with 5 μmol·L-113-cis-retinoic acid. The cells attached to the bottom of the culture dish and protruded cell processes. Most of the cells gained a neuronal morphology and the processes grew much more and longer, then reached into a network

2.2 RT-PCR法檢測NB神經球Oct-4的表達及13-順維甲酸誘導后表達的改變 RT-PCR法檢測到未分化的NB神經球細胞表達Oct-4，13-順維甲酸誘導3 d后，其表達降低，誘導9 d后Oct-4表達消失(圖2)。

圖2 RT-PCR法檢測13-順維甲酸誘導后NB神經球細胞Oct-4的表達

Fig 2 Oct-4 expression of neurosphere cells during the induction detected by RT-PCR

Notes Lane 1 to 3: showing the corresponding GAPDH expression as control;Lane 4 to 6: denoting Oct-4 gene expression of neurosphere cells before induction, 3 and 9 days after induction respectively, the expression level of Oct-4 was decreased with the duration of using 13-cis-retinoic acid increased

2.3 細胞免疫熒光檢測NB神經球13-順維甲酸誘導后nestin的表達 未經13-順維甲酸誘導的NB神經球細胞表達nestin(圖3A)，提示神經球細胞中含有TSC，13-順維甲酸誘導9 d后，nestin的表達已經明顯減弱(圖3B)，提示TSC已經分化。

圖3 細胞免疫熒光檢測13-順維甲酸誘導后NB神經球細胞nestin的表達

Fig 3 Nestin expression of neurosphere cells during the induction detected by cell immunofluorescence

Notes A：Neurosphere cells were positive for nestin before induction；B：Induced by 13-cis-retinoic acid for 9 days neurosphere cells expressed less nestin

3 討論

隨著TSC假說得到越來越多證據的證實，腫瘤的治療理念也發生了改變，真正有效的治療可以針對TSC。傳統的放、化療治療惡性腫瘤主要針對腫瘤中的快速增殖細胞，而不是TSC。雖然短期內腫瘤快速縮小，但遠期療效不佳，復發率較高。原因首先是TSC處于相對靜止期，偶爾進入細胞周期；再者，TSC表達ABCG2、抗凋亡蛋白，具有增強的DNA修復能力[5]，比成熟分化細胞更有耐藥性。TSC的治療方法除了通過依賴TSC表面抗原及信號通路中的關鍵分子來抑制或消除TSC外，另一個有效方法是誘導TSC分化。

高危NB患兒經過誘導化療和清髓性鞏固治療后，大部分還會復發，提示清髓性鞏固治療后很可能還存在含有TSC的微小殘留病灶。許多誘導劑如維甲酸、AMP和神經營養因子等均能誘導人NB細胞株的軸突生長[6]，其中維甲酸主要作用于RAR和RXR兩種受體，是最有潛力的NB微小殘留病灶的誘導劑，能誘導體內細胞分化，同時伴有腫瘤細胞增殖減低[7]。CCG(Children Cancer Group，兒童腫瘤協作組)的一項RCT研究顯示，接受移植后給予13-順維甲酸治療的患兒無事件生存率顯著提高[(46%±6%)vs(29%±6%)，P=0.027]， 對骨髓移植后存在微小殘留病灶的患兒有治療效果[8]。其他的維甲酸，如9-順維甲酸、全反式維甲酸和芬維A胺對高危NB患兒的微小殘留病灶也具有活性。

Oct-4的表達只限于多能干細胞，隨著分化的啟動及多能性的喪失，其表達水平逐漸降低[9，10]。Nestin是一種中等纖維蛋白，被廣泛應用于神經干細胞和祖細胞的特異性標記分子[11]。本研究用無血清培養基體外培養NB細胞，形成富集TSC的懸浮神經球，證實13-順維甲酸能誘導神經球細胞分化，隨誘導時間的延長，干細胞基因Oct-4和神經前體細胞標記nestin的表達逐漸降低，提示13-順維甲酸能有效誘導分化TSC，為臨床將維甲酸用于NB的維持治療提供了實驗依據。

維甲酸能誘導細胞分化已得到了大量實驗的證實，本研究從TSC角度論證了13-順維甲酸是有效的TSC誘導劑，為研究維甲酸治療NB的作用機制提供了新的線索，同時也為腫瘤的治療帶來新的理念。但本研究為體外實驗結果，距離臨床應用尚需進一步實驗研究。

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