白質消融性白質腦病患兒12例臨床與遺傳學研究

冷雪榮 吳 曄 潘艷霞 杜 麗 金 洪 王靜敏 姜玉武

白質消融性白質腦病(leukoencephalopathy with vanish-ing white matter，VWM)是一種常染色體隱性遺傳的白質腦病，是兒童期常見的遺傳性白質腦病之一[1]。VWM是由編碼真核細胞翻譯啟動因子2B(eukaryotic translation initiation factor 2B，eIF2B)的5個亞單位(eIF2Bα、β、γ、δ、ε)的相應編碼基因EIF2B1～5的任一突變引起[2]。eIF2B為5個亞單位構成的五聚體復合物，其中eIF2Bε是重要的亞單位，具有鳥苷酸轉移因子(guanine nucleotide-exchange factor, GEF)活性，直接作用對象為真核細胞翻譯啟動因子2 (eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2)，催化eIF2-GDP向eIF2-GTP轉化；其他4個eIF2B亞單位在調控GEF活性方面具有重要作用。

目前，VWM臨床診斷主要依據典型的臨床表現以及頭顱MRI特點，確診需經基因突變分析。本研究對臨床診斷并經基因突變分析確診的中國VWM患兒進行臨床特征總結，對基因突變特點進行分析，并做初步的突變功能研究。以期提高兒科醫生對該病的認識，并為進一步的遺傳咨詢及了解VWM發病機制打下基礎。

1 對象與方法

1.1 診斷標準 VWM依據van der Knaap等推薦的標準[3]：①早期的精神、運動發育基本正常或輕度落后；②兒童早期出現進行性加重的神經系統功能倒退，發熱或輕微頭部外傷均引起病情加重；③神經系統癥狀主要包括小腦共濟失調，肢體痙攣；④頭顱MRI表現為彌漫性、對稱性大腦白質廣泛受累，累及中央區及皮質下白質，白質異常在T1、T2及FLAIR像上逐漸演變為與腦脊液相同的信號。

1.2 納入標準 以臨床診斷為VWM的患兒為研究對象。

1.3 排除標準 ①常見有機酸、氨基酸、脂肪酸和線粒體代謝病；②已知常見的其他遺傳性白質腦病；③后天獲得性白質病變(腦室旁白質軟化和急性播散性腦脊髓炎等)。

1.4 倫理審核 本研究方案經北京大學第一醫院臨床研究倫理委員會審批，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.5 臨床資料收集 包括：病史及體格檢查；血生化(電解質、血氨、乳酸、丙酮酸及肝、腎功能)檢查；尿有機酸、氨基酸及脂肪酸分析結果；白細胞芳香硫脂酶A和β半乳糖腦苷脂酶活性測定結果；頭顱MRI片。

1.6 基因突變分析

1.6.1 提取外周血白細胞DNA 采集患兒及其父母外周靜脈血各5 mL，抗凝，以常規鹽析法提取外周血白細胞基因組DNA。

1.6.2 突變篩查 國際上報道VWM的120多種突變中[4]，EIF2B5突變最為常見，占57%。EIF2B2突變占15%，EIF2B4突變占17%，EIF2B3突變占7%，EIF2B1突變僅占4%[5，6]。因此，對于每例患兒首先篩查EIF2B5突變，隨后依次篩查EIF2B4、EIF2B2、EIF2B3和EIF2B1突變。PCR擴增包括EIF2B5的16 個外顯子,EIF2B4的13個外顯子，EIF2B2的8個外顯子，EIF2B3的12個外顯子，EIF2B1的9個外顯子，以及所有外顯子-內含子交界區。擴增產物經PAGE檢測，在ABI 3100 測序儀上直接正反向測序，測序結果使用DNASTAR 軟件分析。對于本研究發現的國外未報道的新突變，通過分析氨基酸變化、保守性、家系傳遞分離分析、已知基因多態性數據庫檢索及100例健康成人對照的測序，以確定所發現的突變為致病突變，排除基因多態性。并對其父母進行基因測序，分析突變來源。

1.7EIF2B5突變功能研究

1.7.1 突變的選擇 選擇在患兒中發現的EIF2B5基因的新突變進行功能研究。

1.7.2 質粒構建 將帶有野生型人類eIF2Bε全長cDNA的 PHM表達質粒(加拿大Southampton大學Proud教授饋贈)，利用QuikChange Site-directed Mutagenesis 試劑盒(Stratagene公司)進行定點突變，獲得突變體質粒。N端具有 Hexahistidine (His6)和 Myc標記，以便于檢測蛋白表達。所有的cDNA均經測序驗證。

1.7.3 培養和轉染HEK 293細胞 將HEK 293細胞接種于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中，在37℃和5%CO2條件下孵育。每2 天換液1次。利用lipofecta-mine2000試劑盒(Invitrogen公司)進行細胞轉染，分別轉染野生型及突變型質粒，48 h后提取細胞總蛋白。

1.7.4 提取蛋白 用冰冷的PBS洗細胞2次，將細胞裂解液(50 mmol·L-1Tris HCl，50 mmol·L-1beta-glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate，1 mmol·L-1EDT，1 mmol·L-1EGTA，1% Triton X-100)直接加入細胞中，吹打細胞，使細胞完全裂解。分別將細胞裂解液轉移至EP管，4℃，13 000 r·min-1離心10 min。吸取上清蛋白，-80℃保存。

1.7.5 Western blot分析突變蛋白表達 將蛋白標本加入等體積2× SDS sample buffer，95℃加熱5 min。在8% SDS-PAGE分離，每條泳道蛋白上樣量20 μg，每次電泳包括野生型和突變型的蛋白標本。電泳結束后，用濕轉法電轉蛋白至硝酸纖維素(NC)膜上。轉移后的NC 膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(Anti-myc，Sigma公司)，4℃過夜。用TTBS 洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗(山羊抗兔IgG，北京中山生物技術公司)，室溫孵育1 h，TTBS 充分洗膜，通過魯米諾化學發光法暴光Kodak 膠片，顯示目的條帶。以β-actin作為內參，同一組的目的條帶灰度與β-actin相比，計算相應比值，進行半定量分析。

2 結果

2.1 一般資料 2006至2008年于北京大學第一醫院兒科神經科臨床診斷為VWM患兒12例，其中男8例，女4例。臨床及頭顱MRI表現符合VWM的臨床診斷標準。父母均非近親婚配，患兒間無親緣關系。臨床特征見表1。

2.3 輔助檢查特點 頭顱MRI均呈典型改變：彌漫性、對稱性大腦白質受累，以中央區白質為著，在T1加權像、T2加權像及FLAIR像，受累白質表現為接近或等于腦脊液信號(圖1)。所有患兒其他輔助檢查均未見明顯異常。

圖1 VWM患兒(例1)的頭顱MRI片

Fig 1 Brain MRI from patient 1 with VWM

Notes A:T2-weighted;B:T1-weighted;C:FLAIR;Symmetric and diffuse signal abnormalities in periventricular and subcortical white matter were shown, with low signals in T1-weighted image and FLAIR image, and high signals in T2-weighted image, similar to that of cerebrospinal fluid

2.4 基因突變分析 12例患兒中發現16種基因突變。其中6例患兒為EIF2B5突變，5例為EIF2B3突變，1例為EIF2B2突變。16種基因突變中包括9種國際上未報道的新突變和7種已知突變。7種已報道的突變為EIF2B5：c.943C>T (p.R315C)、c.1340C>T(p.S447L)、c.1016G>C(p.R339P)、c.1157G>T(p.G386V)、c.337C>T(p.R113C)、c.806G>A(p.R269Q)；EIF2B3：c.674G>A(p.R225Q)。9種新突變中7種錯義突變為EIF2B5：c.185A>T(p.D62V)、c.1004G>C(p.C335S)、c.1126A>G(p.N376D)；EIF2B3：c.140G>A(p.G47E)、c.1037T>C(p.I346T)；EIF2B2：c.254T>A(p.V85E)、c.922G>A(p.V308M)； 1種無義突變為EIF2B5： c.805C>T(R269X)；1種缺失突變為EIF2B5：c.1827-1838del(p.S610-D613del)(表1，圖2)。9種新突變均位于進化上的高度保守區，未在100例健康成人對照中發現。1例患兒(例10)僅在一個等位基因上發現了突變，另一個等位基因的編碼區以及外顯子-內含子交界區未發現突變。所有患兒的突變均來自表型正常的父母。

圖2 9種EIF2B新突變的測序圖譜

Fig 2 The chromatograms of sequencing results of 9 novelEIF2Bmutations

Notes A:EIF2B3，c.140G>A, p.G47E ;B:EIF2B3，c.1037T>C, p.I346T (reverse sequencing);C:EIF2B5，c.1126A>G, p.N376D；D:EIF2B5,c.1004G>C, p.C335S;E:EIF2B5,c.805C>T, p.R269X(reverse sequencing);F:EIF2B5,c.185A>T, p.D62V;G:EIF2B5,c.1827-1838del,p.S610-D613;H:EIF2B2,c.254T>A,p.V85G;I:EIF2B2,c.922G>A,p.V308M

2.5EIF2B5突變功能研究EIF2B5新突變p.D62V、p.R269X、p.C335S、p.N376D和p.S610-D613del 中，p.R296X和p.S610-D613del突變引起蛋白表達量顯著降低，Western blot幾乎檢測不到條帶(圖3)。其他3個錯義突變p.D62V、p.C335S和p.N376D蛋白表達量與野生型差異無統計學意義。

圖3 5種EIF2B5突變對eIF2Bε蛋白表達量的影響

Fig 3 Effects of fiveEIF2B5 mutations on the mutant eIF2Bε protein expression

Notes HEK 293 cells were transfected with wild-type or mutant eIF2Bε cDNA, lysates were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylam gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. On immunoblots, eIF2Bε-p.D62V, eIF2Bε-p.C335S and eIF2Bε-p.N376D were present in amounts similar to the wild type, whereas eIF2Bε-R269X and eIF2Bε-S610-D613Sdel were present in a substantially reduced amount, which almost could not be detected

3 討論

VWM是兒童期起病的遺傳性白質腦病中常見的類型之一。VWM臨床表型差異很大，起病年齡可早至胎兒期(先天型，1歲內死亡)或晚至成年期(成年型)，其中以1～5歲起病最為多見(早期兒童型，又稱經典型)。早期兒童型VWM患兒發病前智力和運動發育多正常，少數有輕度運動或語言發育落后。起病表現多為共濟失調，逐漸出現肢體痙攣、構音障礙和驚厥，在病程后期可出現吞咽困難，智力受累相對較輕。臨床特征性表現為遇輕微感染(如上呼吸道感染)所致發熱或輕微頭部外傷后即可引起病情明顯加重，出現運動功能喪失，可伴易激惹、嘔吐、意識障礙，甚至驚厥及昏迷，病程中可逐漸緩慢恢復，發作也可導致死亡。VWM患兒的病程變化個體差異較大，多于起病后數年內死亡，也有存活數十年的報道[7]。本組12例患兒根據起病年齡均屬于早期兒童型。至末次隨訪，病程為9個月至7年，所有患兒均存活。本病典型體征主要為錐體束征陽性，可伴有共濟失調體征，頭圍多正常。本病頭顱MRI具有較獨特的特征，大腦白質病變顯著重于其他遺傳性白質腦病，表現為彌漫性、對稱性大腦白質的液化樣改變，即“白質消融”，以中央區白質受累為著，逐漸波及全部大腦白質。小腦白質也可出現異常信號，但通常不發生液化。本組12例VWM患兒均具有上述典型頭顱MRI特征。

VWM是第1個被確定的因mRNA翻譯啟動異常所導致的人類遺傳疾病，其致病基因在2001至2002年被確定是由elF2B的5個亞單位(elF2Bα、β、γ、δ、ε)的相應編碼基因EIF2B1～5的任一基因突變引起。臨床診斷為VWM的患者95%存在EIF2B1～5基因突變。目前關于VWM的研究對象多為白種人，65%的VWM患者為EIF2B5基因突變所致。EIF2B5基因的錯義突變R113H被認為是一熱點突變，可能發生于近40%的VWM患者中[5,7～9]。在所有已發現的EIF2B1～5突變中，以錯義突變為主，無義突變很少[6]。目前確診的VWM患者中，攜無義突變患者多為無義加錯義的復合雜合子，而非純合無義突變，提示該基因功能非常重要，攜無義突變純合子患者可能不能存活[2]。目前尚無確定的基因型-表型相關性。在本組VWM患兒中，EIF2B突變譜與既往報道存在差異，在16種突變中9種為既往未報道的新突變。突變僅發生在EIF2B5，EIF2B3和EIF2B2上，其中EIF2B5突變占68.8%(11/16)；EIF2B3突變占18.8%(3/16)，高于國外報道的7%[5，6]。5/12例患兒攜帶EIF2B3突變。提示中國VWM患兒EIF2B3突變率可能較高。本研究還發現了EIF2B3的一個熱點突變p.I346T，5例攜帶EIF2B3突變的患兒中，有4例攜帶此突變。既往報道的EIF2B5熱點突變p.R113H在本組VWM患兒中未被發現。因此初步推測中國 VWM患兒可能具有其獨特的EIF2B基因突變譜，與VWM白種人患者的EIF2B突變譜有所不同。但基于本研究樣本量較小，尚需累積更多患兒的基因突變分析結果進一步證實。

elF2B突變導致VWM的發病機制目前尚不十分清楚[10～13]。在真核細胞蛋白翻譯啟動時，elF2-GTP負責將Met-tRNA結合至40S核糖體亞單位上，識別并結合mRNA上相應的起始密碼AUG從而啟動翻譯過程，隨即 elF2-GTP脫磷酸為eIF2-GDP而失去活性。elF2B具有GEF活性，負責eIF2的GDP/GTP轉化，使elF2-GDP再次轉化為具有活性的elF2-GTP，投入下一輪蛋白質翻譯啟動過程[14]。eIF2Bε是最重要的eIF2B亞單位，由721個氨基酸組成，其C末端的第518～712位氨基酸殘基與底物eIF2結合，發揮其GEF活性。N末端500個氨基酸是與其他亞基結合的作用區域，可能影響亞單位之間的結合[14]。eIF2Bε突變可能通過不同途徑影響蛋白功能從而致病，包括影響蛋白表達量、五聚體形成、eIF2B與底物結合等多種途徑。本研究初步結果顯示，p.R296X和 p.S610-D613del突變導致eIF2Bε蛋白表達量顯著下降，因此不能生成足夠具有功能的eIF2B復合體，為嚴重影響功能的突變。p.R296X和 p.S610-D613del突變均發生在復合雜合子中，推測如為突變純合體，因嚴重缺乏有功能的eIF2Bε蛋白，患兒可能無法存活。

本研究首次對中國VWM患兒進行了eIF2B各亞單位的基因突變篩查，并發現了國際上未報道的9種新突變，且初步揭示中國 VWM患兒可能具有與白種人群不同的基因突變譜。目前初步的功能研究結果提示，eIF2Bε的兩種新突變p.R296X及 p.S610-D613del可導致蛋白表達量顯著下降，提示其嚴重影響eIF2Bε蛋白功能。為進一步探討VWM基因型和表型的關系以及VWM的發病機制，本課題組正在繼續收集病例，并進行下一步的突變功能研究。

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