加味四逆散對腸易激綜合征大鼠不同腦區核團c-fos蛋白表達的影響

白 霞,謝小磊,李 夢,耿建國,李冬華,杜宇瓊

(首都醫科大學中醫藥學院,北京 100069)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是一種常見的消化系統疾病?，F代研究發現,腸易激綜合征的發病與慢性心理應激引起的腦腸軸功能紊亂密切相關。中醫認為,腸易激綜合征肝脾失和是發病關鍵,治療應以疏肝健脾為主。本試驗旨在研究加味四逆散方對腸易激綜合征大鼠不同腦區核團c-fos蛋白表達的影響,探討加味四逆散方對大鼠腦腸軸調控機制作用,為臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

Wistar大鼠 24只,清潔級,雄性,體重 180g～220g,購于首都醫科大學實驗動物科學部,動物合格證號 SCXK-(軍)2007-004。正常光照條件,食、水可自由攝取,室溫控制在 18℃～22℃之間。

1.2 藥物

加味四逆散由柴胡 10g、白芍 10g、枳實 10g、炙甘草 10g、炒白術 10g等組成,藥材購自北京國醫堂大藥店,加味四逆散煎煮、過濾、濃縮、配制成濃度為1.35g/m L。陽性對照藥:匹維溴銨片(得舒特片),批號 610996,將藥片碾碎后溶于蒸餾水配制成懸浮液,濃度為 1.79mg/m L。藥物制備后,分別在 4℃冰箱保存。

1.3 主要試劑及儀器

灌注泵(保定蘭格恒流泵有限公司,BT00-100M),免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),光學顯微鏡(Leica DMLA),圖文分析軟件(Leica Qwin)。

2 方法

2.1 動物模型制備

按文獻方法改進,采用束縛制動加灌服番瀉葉改良的方法,制備腸易激綜合征動物模型。將造模大鼠置于制動筒內(自制),通過移動插片而逐步縮小大鼠的活動空間,調節到其不產生強烈反抗的緊張程度,每日制動 1次。每日開始時間及制動時間不同,第 1天為 4h,其后每次增加 30min～60min,造模大鼠在制動期間禁食、禁水。束縛制動后給予番瀉葉煎劑(0.3g/ml)灌胃(20ml/Kg),每日 1次,連續21d。

2.2 分組及給藥

將造模成功的大鼠隨機分成模型對照組、加味四逆散組、得舒特組共 3組,每組 6只。加味四逆散組灌服加味四逆散濃縮液 10.9g/(kg·d),得舒特組灌服得舒特懸浮液 32.14mg/(kg·d),連續 21d,同時正常對照組及模型對照組大鼠灌以蒸餾水20ml/(kg· d),連續 21d。

2.3 檢測方法

2.3.1 大鼠結腸轉運功能 大鼠實驗前 24h禁食,給予 30%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉,取直徑為 3mm的玻璃小球沿肛門放入距肛門 3cm的直腸內。大鼠蘇醒后迅速移至籠內喂食飲水,籠內墊清潔濾紙。觀察 2h內大鼠排便的糞點數和直腸內玻璃小球排出時間。

2.3.2 大鼠小腸運動功能 大鼠以 50%墨汁灌胃(2ml/只),10min后處死。剖取小腸,測量小腸墨汁推進百分率(推進率(%)=幽門至墨汁前沿的距離/幽門至回盲部的距離 ×100%)。

2.3.3 不同腦區核團 c-fos蛋白表達的測定采用免疫組織化學法檢測。用顯微鏡觀察各腦片cfos陽性神經元的標記,細胞核呈棕黃色為 c-fos陽性細胞。以每個單位視野(200μm)內 c-fos陽性神經元的數目來表示數量,具體判斷標準為 21～30個為 +++,11～20個為 ++,2～10個為 +,2個以下為 -,每組 6只取平均值。

3 結果

3.1 藥物對 IBS大鼠結腸運動功能的影響

表1顯示,加味四逆散組與模型對照組結腸轉運功能比較,差異有統計學意義(P<0.01或 P<0.05);得舒特組與模型組對照組比較,玻璃小球排除時間有統計學意義(P<0.05),排出糞點數有差異但無統計學意義(P>0.05)。

表1 藥物對 IBS大鼠結腸轉運功能的影響

表1 藥物對 IBS大鼠結腸轉運功能的影響

注:與模型組比較:P<0.05,P<0.01

組別 n 大鼠糞點數 玻璃小球排出時間(min)正 常 組 6 3.17±0.75 21.83±3.31模 型 對 照 組 6 4.50±0.55 15.33±1.86加味四逆散組 6 3.50±0.84 18.33±1.21得 舒 特 組 6 3.67±0.82 18.17±1.47

3.2 藥物對 IBS大鼠小腸運動功能的影響

表2顯示,加味四逆散組與模型對照組小腸運動功比較有統計學意義(P<0.01),得舒特組與模型對照組比較有統計學意義(P<0.05)。

3.3 大鼠腦區不同核團 c-fos蛋白表達檢測

表3顯示,正常組大鼠紋狀體偶見零星的 c-fos表達,但染色較弱;模型對照組大鼠腦皮質和紋狀體的 c-fos表達多,加味四逆散可明顯降低腦皮質和紋狀體 c-fos陽性神經元,減少 c-fos蛋白表達。

表2 藥物對 IBS大鼠小腸運動功能的影響

表2 藥物對 IBS大鼠小腸運動功能的影響

注:與模型組比較:P<0.05,P<0.01

組別 n 小腸墨汁推進率(%)正 常 組 6 74.36±4.50模 型 對 照 組 6 87.44±5.41加 味 四 逆 散 組 6 75.31±5.62得 舒 特 組 6 78.75±5.56

表3 大鼠不同腦區核團c-fos陽性神經元的變化

表3 大鼠不同腦區核團c-fos陽性神經元的變化

組別 n 腦皮質 紋狀體正 常 組 6 - ±模型對照組 6 ++++ +++加味四逆散組 6 ++ ++得 舒 特 組 6 ++ ++

4 討論

C-fos原癌基因的表達及作用強度可作為判斷神經細胞損傷程度的一種分子生物學標志。在正常情況下,c-fos在腦內水平極低,難以測到,多種外界刺激可誘導神經系統內 c-fos表達。目前中樞神經在 IBS發病中的作用研究較多。已有研究證實,疏肝理氣、調暢情志在整體上,可能與調節慢性心理應激反應與中樞多種神經遞質及其合成酶、神經肽、激素、環核普酸系統以及 c-Fos蛋白的表達有關,表現出多層次、多靶點及多環節的作用特點。

本研究根據 IBS病因病機,選用由四逆散化裁而成的加味四逆散。四逆散源于張仲景的《傷寒論》,是疏肝和脾的基礎方,現代應用十分廣泛,臨床多用于消化系統疾病和婦科疾病等,均取得較好療效。加味四逆散是由柴胡、白芍、枳實、炙甘草、炒白術等組成,柴胡解郁行氣、和暢氣機、透達郁陽;枳實行氣散結;芍藥合營益陰;炒白術健脾止瀉;炙甘草緩急和中,具有疏暢氣機、透達郁陽、健脾止瀉之功效。腸易激綜合征臨床多表現為肝脾不和,對于IBS肝郁脾虛的病機十分合拍。

我們采用束縛制動加灌服番瀉葉的方法復制IBS動物模型。研究發現,造模期間大鼠毛色干枯無光澤,煩躁易怒,喜扎堆,大便多稀溏,甚則脫肛,符合中醫肝郁脾虛的診斷標準,說明動物模型制備成功。大鼠給予藥物治療后,毛色變得光澤,反應靈敏,大便逐漸恢復正常。實驗結果表明,加味四逆散組大鼠玻璃小球排出的時間比模型對照組大鼠時間顯著延長(P<0.01),同時大鼠排的糞點數比模型對照組明顯減少(P<0.05),說明加味四逆散組大鼠結腸轉運功能均有改善;加味四逆散組大鼠比模型對照組大鼠小腸墨汁的推進率明顯減少(P<0.01),說明加味四逆散組大鼠的小腸運動功能亦有改善。通過慢性刺激方法,誘導 c-fos在大鼠腦區不同核團蛋白表達,顯示加味四逆散能減少大鼠大腦皮質和紋狀體 c-fos蛋白表達數目,說明加味四逆散方對腸易激綜合征大鼠腦腸軸有重要的調控作用。加味四逆散方通過何種途徑影響腸易激綜合征大鼠腦腸軸的調控機制,尚有待進一步深入研究。