超聲波輔助提取RP-HPLC法測定滸苔中的葉綠素a、b

程紅艷, 陳軍輝, 張道來, 趙恒強, 鄭 立, 臧家業, 王小如,2

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋生態研究中心, 山東 青島266061; 2．廈門大學 化學化工學院 化學系,福建 廈門 361005)

超聲波輔助提取RP-HPLC法測定滸苔中的葉綠素a、b

程紅艷1, 陳軍輝1, 張道來1, 趙恒強1, 鄭 立1, 臧家業1, 王小如1,2

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋生態研究中心, 山東 青島266061; 2．廈門大學 化學化工學院 化學系,福建 廈門 361005)

建立了一種反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定滸苔(Enteromorpha prolifera)中葉綠素a和b含量。采用的色譜條件：Diamonsil-C18(4.6 mm×150 mm)柱, 流動相為甲醇(含0.2%的乙酸)和丙酮, 梯度洗脫, 流速為0.8 mL/min, 進樣量10 μL, 檢測波長430 nm。在此條件下, 葉綠素a和葉綠素b與滸苔中的其他化合物分離良好, 葉綠素a、b質量濃度為0.50～500 mg/L具有良好的線性關系(R2=0.999 9),能對滸苔提取液中的葉綠素a、b進行準確定量。

滸苔(Enteromorpha prolifera); 葉綠素; 高效液相色譜法

隨著經濟的發展, 人民生活水平的提高和健康保健意識的增強, 人們對食品的營養價值和標準提出了更高的要求。由于天然色素不但無害無毒, 還具有食品本身的色澤, 促進食欲, 增加消化液的分泌,對人體有醫療和保健作用。因此尋找和開發天然色素已成為食用色素發展的必然趨勢。葉綠素是綠色植物中廣泛存在的一類脂溶性色素, 其結構與人類和大多數動物體內血液中紅色素結構及其相似, 在某種意義上講, 也是維持生命不可缺少的物質, 具有抗突變、促愈創傷、抗變應性、降低膽固醇、改善便秘等作用[1]。因此天然葉綠素的開發具有廣闊的前景。

海洋植物中葉綠素和其他輔助色素的含量高于陸生植物, 而且海洋植物生長快、產量大, 是天然葉綠素開發的良好原料[2]。滸苔作為海洋中的藻類植物,可以作為開發天然葉綠素的資源之一。然而目前國內還沒有關于綠潮藻滸苔中最主要的葉綠素a、b含量測定的報道, 也缺乏滸苔中葉綠素 a、b快速測定的有效方法。葉綠素的測試方法主要有三類, 分別是分光光度法、熒光法和高效液相色譜法(HPLC)[3]。其中 HPLC法能對色素粗提物中的葉綠素單體及其衍生物分離, 是目前葉綠素單體準確測定最有效的方法[4]。吳振斌等[5]發展了微囊藻中葉綠素-a、β-胡蘿卜素及脫鎂葉綠酸-a同步測定的 HPLC法, 戴榮繼等[6]采用HPLC法對飲用水中藻類葉綠素a、b的含量進行了測定, Huang等[7]采用高效液相色譜-質譜法對絞股藍中的葉綠素及其衍生物進行了分析測定,而采用HPLC法測定綠潮藻滸苔中葉綠素a、b的研究未見報道。本研究首次采用現代提取技術——超聲波輔助提取法對滸苔中的葉綠素進行高效快速提取,通過對色譜條件的系統優化,建立了適用于綠潮藻滸苔中葉綠素a、b快速測定的RP-HPLC法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑與原料

Agilent 1200高效液相色譜儀, 配有二極管陣列檢測器(DAD)、自動進樣器、四元梯度泵等(美國Agilent公司); KQ-400KDE 型高功率數控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司); R201 型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司); FA1104型電子天平(上海精天電子儀器廠); Milli-Q(18.2 MΩ) 超純水處理系統(美國 Millipore 公司)。

Diamonsil-C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm, 5 μm,中國 Dikma); Zorbax Bonus-RP C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm, 5 μm), Extend-C18色譜柱 (4.6 mm ×200 mm, 5 μm), Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)皆為美國Agilent公司生產。

甲醇、乙腈、乙酸、丙酮(Merck, 色譜純), 及其他試劑均為國產分析純; 葉綠素 a、b標準品(美國Fluka公司, 純度為95%); 實驗中所用溶液均用超純水配制, HPLC用所有試劑均經過0.45 μm微孔濾膜過濾及超聲脫氣處理。滸苔樣品為2008年7月份采自青島近岸, 在超低溫冰箱中冷凍保存。

1.2 色譜條件

迪馬 Diamonsil-C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)色譜柱; 流動相為：甲醇含有 0.2% 乙酸(A), 丙酮(B),梯度洗脫程序見表1, 柱溫 25℃, 流速 0.8 mL/min, DAD 430 nm檢測, 進樣量為10 μL。

表1 流動相的梯度洗脫程序Tab. 1 Gradient program of mobile phase

1.3 標準溶液的配制

分別取葉綠素a、b標準品(1.0 mg包裝), 置于10 mL容量瓶中, 用色譜純甲醇定容至10 mL得到濃度為100 mg/L的葉綠素a、葉綠素b標準儲備液, 取少量標準品儲備液稀釋至合適濃度, 并配制混合標準品溶液, 用于色譜條件的優化和標準曲線的繪制,標準品儲備液密封后置于超低溫冰箱中冷凍保存。

1.4 供試品溶液的制備

平行精密稱取6份新鮮滸苔樣品各0.1 g, 其中3份置于15 mL玻璃離心管中, 加入5 mL甲醇, 超聲波提取5 min, 用0.45 μm微孔濾膜過濾, 置于棕色進樣瓶中, 待測。另外3份置于玻璃表面皿, 然后置于干燥箱中, 在60℃條件下烘干至恒質量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

據文獻報道[4～7], 反相HPLC技術較常用于葉綠素的分析測定, 而甲醇-水-丙酮以及甲醇-丙酮混合液多作為分離葉綠素的流動相; 考慮到葉綠素是一種極性較小、易于被反相柱保留的化合物, 而滸苔粗提物所含的化合物又較為復雜, 因此以不同比例的甲醇-丙酮混合液為流動相, 對 4根不同特點的反相C18柱進行了比較優化, 結果發現, 不同特點的色譜柱對滸苔中葉綠素及其衍生物的分離結果差異較大(特別是滸苔中葉綠素部分降解后生成了系列葉綠素衍生物), 4根色譜柱當中迪馬公司的 Diamonsil-C18所獲得的分離結果最為理想(各峰分離度高, 峰型對稱), 這就說明在滸苔中葉綠素及其衍生物的 HPLC分析中, 選擇合適的色譜柱是非常關鍵的。

在選定色譜柱之后, 對以甲醇-丙酮以及甲醇-水-丙酮為流動相進行了比較, 結果表明以甲醇-丙酮為流動相時分離效果較好; 據文獻報道[4], 流動相中添加一定量的酸或緩沖鹽可以改善葉綠素及其衍生物的峰型及分離效果, 在本研究中分別將 0.2%磷酸、0.2%乙酸、5 mmol/L乙酸氨、5 mmol/L磷酸鹽加入流動相中, 結果顯示, 流動相中添加 0.2%的乙酸能獲得理想的分離結果, 并且使用乙酸配制流動相簡單方便、不損壞柱子和儀器硬件, 乙酸具有揮發性與質譜檢測器兼容, 利于液相色譜-質譜聯用分析葉綠素方法的開發。

葉綠素在可見光區有較強的特征吸收峰, 但是葉綠素a和b的最大吸收波長不同, 為了使葉綠素a和b均能獲得較高的靈敏度, 本研究通過DAD全波段掃描(400～800 nm), 考察了不同檢測波長對葉綠素a、b測定靈敏度的影響(圖1), 結果表明430 nm為檢測波長時, 葉綠素a、b檢測的靈敏度均較高, 并且能排除其他化合物的干擾, 與文獻[8]的結果一致,因此, 選擇430 nm作為滸苔中葉綠素a、b同步測定的最佳檢測波長。

作者主要根據標準品的保留時間對葉綠素a和b的色譜峰定性, 將樣品測定色譜圖與標準品色譜圖進行比較, 以確定葉綠素a和b的相應峰位。此外,實驗中還分別以適量的標準溶液加入樣品溶液中同步分析, 通過對比各峰的峰面積值, 進一步確認峰面積明顯增大的峰為葉綠素a和b峰。按1.2色譜條件測定對照品溶液和供試品溶液, 色譜圖如圖2所示, 比較圖2 A和B可知, 在選定的色譜條件下葉綠素a、b色譜峰對稱性好, 與其他組分達到基線分離,可準確測定其峰面積, 并以峰面積進行定量分析。

2.2 超聲波輔助提取條件的優化

超聲波輔助提取是利用超聲場強化提取天然產物中目標化合物的現代提取方法, 其原理[9]是：存在于物質中的微氣核(空化核)在超聲場的作用下產生振動、生長和崩潰的過程(即超聲空化效應), 從而產生局部的高溫高壓, 增強物質在溶劑中的溶解能力。采用超聲波輔助提取法提取葉綠素的研究已有報道[10,11],均獲得了較為理想的提取效率, 但未見用于滸苔葉綠素的提取。在本研究中選用丙酮為提取劑, 將超聲提取法與冷浸法、回流法、索氏提取法進行了比較,結果表明超聲輔助提取法方便、快捷(處理一個樣品僅需5 min)、提取效率高、便于操作, 是最佳提取方法。由于葉綠素不溶于水, 易溶于醇、丙酮等有機溶劑, 在本實驗中應用超聲提取法, 比較了甲醇、乙醇、丙酮、乙醇-丙酮(v/v=50：50)及甲醇-丙酮(v/v=50：50)作為提取液的提取效果, 結果表明, 上述幾種溶劑為提取溶劑時新鮮滸苔中的葉綠素a、b均能得到充分提取, 由于采用甲醇做提取溶劑時利于后續色譜分析, 可以簡化樣品前處理過程, 所以選擇甲醇為提取溶劑。對提取溶劑用量、不同提取時間的提取效果進行了比較, 結果表明, 稱取 0.1 g鮮滸苔,以5 mL甲醇超聲提取5 min為宜。超聲提取過程中,溫度發生一定波動, 經考察對實驗基本沒有影響,故提取過程中無需嚴格控溫。在以上最佳條件下, 提取一次即可獲得 99%以上的目標化合物, 故無需多次提取。

圖1 葉綠素a、b的DAD掃描光譜圖Fig. 1 The DAD scan spectrums of chlorophyll a and chlorophyll b

圖2 葉綠素a、b混合標準品(A)及滸苔提取液(B)高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms of mix standards for chlorophyll a, b (A) and the extract of Enteromorpha prolifera (B)

2.3 試驗方法考察

2.3.1 標準曲線的繪制及檢出限

本研究采用外標法對滸苔中葉綠素 a和 b進行定量, 用峰面積對質量做工作曲線, 由試樣峰面積求出其實際含量。按1.2所述的色譜條件, 取葉綠素a和b的混合標準液(質量濃度均為50 mg/L)分別進樣 0.1、0.2、0.4、1.0、4.0、10、40、100 μL, 以測定的峰面積為縱坐標, 標準品的質量(μg)為橫坐標繪制標準曲線, 得線性回歸方程分別為：

葉綠素a的標準曲線方程為：y=5 373.3x-21.775 1,R2=0.999 9

葉綠素b的標準曲線方程為：y=4 903x-117.15,R2=0.999 9

說明本方法測定葉綠素 a和 b均在 0.50 ～500 mg/L范圍內線性關系良好。將標準溶液逐級稀釋進樣, 測其峰高響應值及基線噪音強度, 以3倍信噪比計算檢出限。檢測波長為430 nm時綠素a和b的檢測限分別為 0.25 μg /L 和 0.75 μg/L。

2.3.2 精密度

按1.2所述的色譜條件, 取1份供試品溶液, 重復測定5次(進樣量為10 μL), 記錄各次的峰面積和保留時間, 葉綠素 a和 b峰面積的 RSD值分別為1.23%和2.34%, 保留時間的RSD值分別為0.42%和0.38%, 這表明儀器的精密度良好。

2.3.3 重復性

精密稱取同一樣品5份, 按1.4處理方法將其制成供試品溶液, 按1.2液相色譜條件, 分別進樣測定,測得葉綠素a和b的峰面積和保留時間, 計算其相對標準偏差, 葉綠素 a和 b峰面積的 RSD值分別為5.02%和5.46%, 保留時間的RSD值分別為 0.49%和0.41%, 表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性

由于葉綠素穩定性較差, 本研究對滸苔甲醇提取液中葉綠素a、b的穩定性進行了系統考察, 按1.4處理方法制備供試品溶液, 制備完成后立即按1.2液相色譜條件, 分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、8、16、24 h進樣測定, 結果顯示滸苔甲醇提取液葉綠素a、b峰面積在3 h內均無明顯變化, 峰面積的減小率均小于5.00%, 但是8 h之后進行測定(樣品瓶一直放在HPLC色譜儀上, 室溫), 葉綠素a和b的峰面積明顯減小, 而24 h之后的測定結果顯示, 葉綠素b幾乎完全降解。以上結果表明, 滸苔提取液中的葉綠素a、b在3 h內其化學性質穩定, 為了獲得準確的測定結果, 樣品制備完成后, 盡量在3 h以內完成HPLC測定。

2.3.5 回收率

精密稱取已知葉綠素a、b含量的同一滸苔樣品3份, 分別加入一定量的葉綠素a和b標準品溶液(放置30 min), 然后按1.4供試品溶液的制備方法處理,用1.2所述色譜條件測定加樣回收率, 結果見表2。由表2結果可以看出, 該方法回收率較高, 進一步說明本方法可用于滸苔樣品中綠素a、b含量的測定。

表2 滸苔葉綠素a和b加樣回收率實驗結果(n=3)Tab. 2 Results for recovery of chlorophyll a and chlorophyll b(n=3)

2.4 滸苔樣品中葉綠素a和b的含量測定

取 5個不同采集地點的滸苔樣品, 每個樣品取質量相等的6份, 按1.4所述處理方法將其中3份樣品制備成供試品溶液, 另外3份滸苔樣品經干燥箱烘干, 稱質量, 得出每份滸苔樣品的干質量, 用以計算滸苔中葉綠素a和b的實際含量。按1.2所述儀器條件測定供試品溶液, 將測得的峰面積代入2.3所得出的回歸方程,計算單位質量干滸苔中葉綠素a和b的含量, 5個不同采集地點滸苔樣品中葉綠素a和b的測定結果見表3。

由表3的數據結果可以看出, 滸苔中葉綠素a和b的含量占滸苔干質量的1%左右, 而滸苔中葉綠素a和葉綠素b的含量比約為3：1, 表明新鮮滸苔中的綠色素以葉綠素 a為主; 此外, 由圖2B可以看出, 滸苔提取物中除了含有豐富的葉綠素 a、b之外, 還含有一系列葉綠素衍生物(與葉綠素a具有相似的可見光吸收圖譜), 進一步表明滸苔中含有豐富的天然葉綠素, 至于這一系列衍生物分別是什么化合物, 有待采用液質聯用技術進行分析鑒別。

表3 滸苔樣品中葉綠素a和b的含量(n=3)Tab. 3 Contents of chlorophyll a and chlorophyll b in different Enteromorpha prolifera(n=3)

3 結論

本研究所發展的超聲波輔助快速提取RP-HPLC測定滸苔中葉綠素a和b含量的方法, 樣品前處理簡便易操作、提取效率高; 在選定的色譜條件下, 葉綠素a和b分離度高, 方法重復性好、回收率高, 可作為滸苔中葉綠素 a和 b含量快速測定的有效方法。滸苔中含有豐富的天然葉綠素, 說明滸苔是天然葉綠素開發的良好原料, 為綠潮藻滸苔資源化利用提供了科學依據。

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Determination of chlorophyll a and chlorophyll b inEnteromorpha proliferaby ultrasound-assisted extraction with RP-HPLC

CHENG Hong-yan1, CHEN Jun-hui1, ZHANG Dao-lai1, ZHAO Heng-qiang1,ZHENG Li1, ZANG Jia-ye1, WANG Xiao-ru1,2
(1. Research Center for Marine Ecology, First Institute Oceanography of SOA, Qingdao 266061,China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005,China)

Mar. ,12, 2009

Enteromorpha prolifera; Chlorophyll; HPLC

A convenient and user-friendly reverse phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC)analysis method was established for the determination of chlorophyll a and chlorophyll b inEnteromorpha prolifera.The following HPLC conditions are follows：Diamonsil-C18(4.6 mm×150 mm) column is used; MeOH-0.2% acetic acid and acetone as the mobile phase with linear gradient elution are used; flow-rate is 0.8 mL/min, detection length of Vis is 430 nm; injection volume is 10 μL. The results indicated that the developed method can be used for the determination of chlorophyll a and b inE. proliferawith a good resolution and linearity between 0.50～500 mg/L(R2=0.999 9).The method is specific, simple, fast, sensitive and feasible for the determination of chlorophyll a and chlorophyll b, which can eliminate the interference of chlorophyll derivatives inE. prolifera.

Q503; O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2010)02-0023-05

2009-03-12;

2009-07-25

國家自然科學基金項目 (20905017, 20602009); 海洋公益性行業科研專項項目(200705011, 200805039); 國家海洋局 第一海洋研究所基本科研業務專項項目(GY-022008T32, GY-022008G47)

程紅艷(1983-), 女, 山東濟寧人, 碩士研究生, 主要從事海洋天然產物化學研究, E-mail：chenghongyan710@163.com; 陳軍輝, 通信作者, 電話：0532-88966705, E-mail：jhchen@fio.org.cn

康亦兼)