胃病患者胃黏膜真菌感染的檢測

鄭劍玲,王垂杰,齊 賀,傅紀婷,李玉峰,段 薇

(1.遼寧中醫藥大學遼寧省基礎醫學研究所免疫微生物室,遼寧沈陽 110101;2.遼寧中醫藥大學附屬一院消化科,遼寧沈陽 110032)

胃潰瘍是臨床常見的多發性消化系統疾病,也是胃癌的癌前病變,嚴重影響患者的消化功能和生活質量,對胃潰瘍的預防學研究具有重要意義。除了目前普遍認為幽門螺桿菌感染與胃潰瘍、胃癌的發生和轉化有密切關系[1]之外,也有胃潰瘍、胃癌合并真菌感染的報道[2-3],但目前尚未見到關于寄居于胃黏膜的真菌的基因多態性與潰瘍病損程度關系的研究報道。核糖體DNA的內轉錄間隔區(internal transcribed spacer region,ITS)的ITS1-ITS2部分進化較快,具有種間特異性和種內保守性,是用于真菌種類鑒定和進化方式的重要遺傳信息研究的工具[4]。本研究通過檢測胃炎和胃潰瘍、胃癌患者胃黏膜寄居的真菌ITS序列基因多態性,了解胃黏膜真菌的菌種多樣性及其與胃潰瘍的關系,為胃潰瘍預防學研究奠定微生物學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 采集2008年7月至8月間消化科就診患者的胃鏡鉗取胃黏膜標本63例(所有研究對象均知情同意,自愿參加本項研究),近3個月內未使用糖皮質激素等免疫抑制劑,無腫瘤、糖尿病等導致免疫低下的系統性疾病。

1.1.2 試劑 CHROM agar假絲酵母菌顯色培養基(鄭州博賽生物技術股份有限公司);酵母樣真菌生化鑒定管(杭州天和微生物試劑有限公司);lyticase(Sigma,US);protease K(Merk,Ger many);Tris、EDTA、SDS(Sigma,US);dNTP(Roche,Switzerland);TaqE(TaKaRa,大連寶生物工程有限公司);genefinder核酸染料(Bio-V,廈門百維信生物科技有限公司);DNA分子量標準為DL2000 Marker(大連寶生物工程有限公司);真菌ITS序列通用引物[5](上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.1.3 儀器 Olympus DP 71圖像采集系統(Tokyo,Japan); Image Pro Plus 4.5 sof tware(Media Cybernetics Inc.,Silver Spring,MD,USA);DYY-8B型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠);藍盾TM551可見光凝膠電泳-透射儀(Bio-V,廈門百維信生物科技有限公司);80-1離心機(上海手術器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 樣本的采集 樣本來自2008年7月7日至8月25日于遼寧中醫藥大學消化科胃鏡檢查的患者,經知情同意,自愿參加本項研究,共63人。男性41名,女性22名,年齡3～81歲,平均年齡38.78歲。用胃鏡鉗取胃竇部黏膜組織樣本,約3 mm×2 mm×1 mm大小,置于無菌Ep管中,-20℃保存。同時記錄受檢者年齡、性別、學歷、吸煙、飲酒習慣、胃鏡檢查所見、病理診斷、病史、用藥治療情況。

1.2.2 真菌分離培養 胃黏膜樣本加入20μL生理鹽水稀釋,吹打混勻。取20μL樣本液,接種于CHROM agar假絲酵母菌顯色培養基,37℃培養3 d,依據分離培養菌落顏色進行鑒定(白假絲酵母菌呈綠色,熱帶假絲酵母菌呈藍色,光滑假絲酵母菌呈紫色,克柔假絲酵母菌呈粉色,其余假絲酵母菌呈白色)。

1.2.3 真菌菌種形態學鑒定 采用微量培養法:將分離培養得到的菌株接種于玉米吐溫80培養基[6],37℃培養24 h。加入亞甲基藍染色,加熱融化瓊脂,蓋上蓋玻片,光學顯微鏡下觀察,并攝像記錄其孢子形態。

1.2.4 真菌菌株的ITS序列檢測菌種多樣性①真菌DNA提取:取分離培養的白假絲酵母菌5 μL,置1 mL液體沙保羅培養基中增菌。菌液加入3 mg/mL的溶細胞酶(以山梨醇溶液配制)5 μL,37℃水浴過夜,去細胞壁。常規酚-氯仿法提取DNA;②PCR擴增:用真菌ITS序列通用引物ITS1:TCCGTAGGTG AACCT GCGG;ITS4:TCCTC CGCTTATTGA TATGC進行PCR擴增。PCR體系(50μL):H2O 41μL,10×buffer 5.0μL,10 mmol/L dNTP 1μL,20μmol/L前引物0.5μL,20 μmol/L后引物0.5μL,5 U/μL TaqE 0.25μL,DNA模板2μL。循環條件:95℃熱啟動5 min;95℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,40個循環;72℃10 min;4℃保存。2%瓊脂糖1×TAE緩沖液,genefinder核酸染料染色,110 V 30 min電泳。PCR產物500～900 bp,紫外線凝膠掃描成像,并記錄實驗結果;③ITS序列限制性片段長度多態性檢測(Restriction fragment length polymorphism,RFLP):RFLP真菌菌種鑒定方法參見文獻[2]。取20μL PCR產物,加入10 U Msp I液,操作參照說明書。

1.2.5 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件對數據進行pearsonχ2檢驗,ANOVA方差分析,Kendall等級相關分析,對ITS序列酶切結果、病理診斷、年齡、性別、學歷、吸煙、飲酒習慣等各觀察指標進行比較分析。P<0.05為顯著統計學意義。

2 結果與分析

2.1 胃黏膜真菌分離培養檢測結果

32個樣本(32/63,50.8%)檢出真菌陽性。CHROM agar假絲酵母菌顯色培養基檢測結果,31個樣本呈綠色為白假絲酵母菌,1個樣本呈紫色為光滑假絲酵母菌。CHROM agar假絲酵母菌顯色培養基檢測結果見圖1。

圖1 CHROM agar假絲酵母菌顯色培養基檢測結果Fig.1 CHROM agarCandidaculture medium results

2.2 玉米吐溫80培養基厚壁孢子法菌種鑒定結果

31個白假絲酵母菌菌株樣本產生較大圓形厚壁孢子,部分有明顯假菌絲。1個光滑假絲酵母菌呈較小類圓形孢子,無菌絲。形態學檢測結果見圖2。

圖2 光學顯微鏡下形態學檢查結果,亞甲基藍染色(40×)Fig.2 Microscope morphological examination results,methylene blue staining(40×)

2.3 ITS序列RFLP檢測結果

32個真菌菌株樣本均可擴增出ITS1-2基因序列,31個白假絲酵母菌菌株樣本PCR產物約為535 bp,1個光滑假絲酵母菌株樣本PCR產物約為871 bp。用限制性內切酶Msp I酶切后,31個白假絲酵母菌菌株樣本酶切產物為297 bp和238 bp的2個條帶,1個光滑假絲酵母菌菌株樣本酶切產物為557 bp和314 bp的2個條帶。ITS序列PCR結果及Msp I酶切后結果見圖3。

圖3 ITS序列RFLP檢測結果Fig.3 Electrophoresis figures for ITS sequences

2.4 ITS序列分析

淺表性胃炎、萎縮性胃炎、膽汁反流性胃炎,共抽取7個樣本進行ITS測序。糜爛性胃炎抽取7個樣本,胃潰瘍抽取7個樣本進行ITS測序。抽取胃癌1個樣本進行ITS測序。ITS序列系統進化樹見圖4。

2.5 真菌檢出陽性與病理診斷及流行病因素相關性分析

經Kendall等級相關分析,真菌陽性與病理診斷成正相關(r=0.263,P=0.027),與性別、年齡、吸煙、飲酒、學歷的相關性,均無統計學意義(P>0.05)。在淺表性和萎縮性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、胃癌樣本中真菌陽性率狀況見表1。

表1 在淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、胃癌樣本中真菌檢出陽性率狀況Table 1 Positive rate of fungi from samples of patientswith superficial gastritis,erosive gastritis,gastric ulcer,gastric cancer

圖4 22個真菌菌株測序樣本ITS序列系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ITS sequence from 22 fungal strains

3 討 論

胃腸道內正常微生物菌群與宿主建立了一種相互依存、相互制約的微生態關系,有誘因時會出現定植在胃腸道的潛在病原菌感染。胃內各種疾病的真菌感染率報道不一,以胃潰瘍并發真菌感染多見,其發病率一般為9.1%～33%[7]。陶文洲報道胃癌合并胃真菌感染者達50%[3]。本實驗對63名胃炎、胃潰瘍和胃癌患者胃黏膜標本經分離培養真菌,結果顯示陽性率為50.8%。

Zwolinska等學者于2006年檢測了293個消化不良和胃潰瘍患者的胃黏膜活檢樣本,他們用API系統檢測從胃潰瘍樣本分離培養出真菌菌種,光滑假絲酵母菌占42.4%,白假絲酵母菌占38.7%[2]。本實驗分離培養出的胃炎和胃潰瘍患者的胃黏膜真菌樣本絕大多數為白假絲酵母菌,與現有的報道不盡相同,本實驗鑒定真菌菌種采用的是ITS序列檢測方法,所以白假絲酵母菌檢出率差異可能與樣本選取和檢測方法有關。

本實驗選取ITS序列作為對白假絲酵母菌多樣性檢測方法,因真核細胞核糖體rRNA基因編碼DNA序列為18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA的串聯重復,其中ITS1和ITS2為內含子轉錄間隔區,ITS1-ITS2部分受自然選擇壓力小,進化速度較快,從中可以獲得較多的進化信息。同時,5S rRNA-5.8S rRNA rRNA-28S rRNA高度保守,具有種間特異性和種內保守性。對真菌的ITS序列進行分析,可以獲得真菌種類鑒定和進化方式的可靠遺傳信息,將ITS序列提交GenBank,與全球各地提交的真菌ITS進行序列比對,從而了解相關真菌菌種和菌株的同源性關系、進化方向和分布情況,已經廣泛應用于真菌的分類進化方面的研究[8]。

在人體內寄居的真菌主要是假絲酵母菌屬,其中以白假絲酵母菌最為常見。本實驗分離培養真菌32(32/63,50.8%)株,經ITS序列測序鑒定檢測到的真菌以白假絲酵母菌為主,白假絲酵母菌31株,光滑假絲酵母菌1株。白假絲酵母菌是重要的條件致病性真菌,在機體免疫功能低下、消化道黏膜生物屏障功能受損時轉化為致病菌,其致病性與菌體的黏附、芽管生成、疏水性和胞外酶等有關[9]。白假絲酵母菌有菌絲相和酵母相兩種生存形式,菌絲相更易黏附和入侵宿主組織,是該菌在體內的主要致病形式[10-13],但這是假菌絲。伴有白假絲酵母菌感染的消化道黏膜增生病變,將出現癌變比例的增高。有研究顯示,白假絲酵母菌胃癌株的毒力及侵襲能力均較正常人口腔菌株強大[14],表明胃病患者與正常人體內白假絲酵母菌存在差異。從基因水平上判斷何種差異是最精確的,需對胃病患者與正常人體內白假絲酵母菌真菌菌株測序分析,構建ITS序列系統進化樹。本實驗發現在淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、胃癌樣本中真菌檢出陽性率呈現出隨著病情的加重而逐漸上升的趨勢。為此本實驗選取22個樣本的真菌菌株測序分析,構建ITS序列系統進化樹,結果顯示真菌基因序列的差異與所致病理損害存在相關性。病理損害程度相近似的樣本,其菌株基因型之間同源性較高。因為受限于基因測序樣本例數,僅對這一現象進行初步探討,尚不能得出具有統計學意義的結論,進一步明確其相關性有待更深入實驗研究。

從慢性胃炎到最終發展為胃癌的演變過程中,各種致病因子可能單獨或協同作用于不同的階段,微生物感染是其中一個很重要的因素。目前已普遍認為幽門螺桿菌感染是引起胃潰瘍的病因,而同樣可以在胃腸道黏膜寄居的真菌在胃癌、胃潰瘍的發生、發展上可能起一定作用,在這一過程中微生物菌群間的相互作用值得重視,它們之間的關系如何仍有待進一步的探討研究。

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