Tetramer技術(shù)檢測人乳頭瘤病毒抗原特異性T細(xì)胞條件的優(yōu)化

王雪蓮,王冬冬,谷秋紅,李 維,安春麗

(1.中國醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室,遼寧沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科,遼寧沈陽 110004;3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院感染科,遼寧沈陽 110004;4.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科,遼寧沈陽 110001)

臨床流行病學(xué)和分子流行病學(xué)研究結(jié)果表明,人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的首要因素。幾乎所有的宮頸癌及其前體病變(鱗狀上皮內(nèi)瘤變)中均可檢測到HPV DNA[1-2],并以高危型HPV16最為常見,占50%以上[2]。高危型HPV編碼的早期蛋白E6、E7是宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵因子,在HPV誘導(dǎo)腫瘤形成及維持腫瘤細(xì)胞惡性表型過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2-3]。二者持續(xù)表達(dá)在所有宮頸癌細(xì)胞中,是宮頸癌的特異性蛋白。研究證實,E6、E7蛋白具有免疫原性,針對這兩個蛋白的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)在清除HPV感染細(xì)胞和病毒轉(zhuǎn)化形成的腫瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用,因此檢測體內(nèi)HPV特異性CTL的頻數(shù)和功能有助于了解病毒感染者或?qū)m頸癌患者體內(nèi)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng),以及疫苗的免疫效果。本研究利用加載HPV16 E6表位抗原肽(E6 133-142;HN I RGRWTGR)的HLAA6801四聚體(Tetramer),即HPV16 E6 133-142/HLA-A6801-PE Tetramer,通過檢測含有HPV特異性CTL的PBMC標(biāo)本,優(yōu)化Tetramer染色的實驗條件,探討染色的最佳溫度及Tetramer濃度,為進(jìn)一步檢測HPV感染者或?qū)m頸癌患者體內(nèi)抗原特異性的CTL打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 HPV抗原特異性的CTL 取HPV感染后病毒自發(fā)清除者外周血,Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC),免疫磁珠法分離CD8+T細(xì)胞,HPV16 E6蛋白體外刺激后,有限稀釋法篩選T細(xì)胞克隆,EL ISPOT、51Cr釋放實驗證實為HPV16 E6 133-142特異性的CTL,遞呈抗原的HLA分子為HLA-A6801[4]。

1.1.2 主要試劑 四聚體HPV16 E6 133-142/HLA-A6801-PE由美國N IH Tetramer facility合成;熒光標(biāo)記抗體anti-CD3-PerCP,anti-CD8-Alex,anti-CD4-FITC,anti-CD14-FITC,anti-CD19-FITC,anti-CD8-PerCP,anti-CD45RO-allophycocyanin(APC)購自BD Biosciences公司;淋巴細(xì)胞分離液Ficoll、RPM I1640、FBS、BSA及sodium azide為Fisher Scientific產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀Becton Dickinson FACSCalibur為BD Bioscience公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PBMC制備及HLA分型 靜脈采集未感染HPV的健康自愿者全血200 mL,Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。取2×107PBMC,免疫磁珠法分離CD3-細(xì)胞,EB病毒轉(zhuǎn)化形成永生化的B淋巴母細(xì)胞系(EBV-transfor med lymphoblastoid B cell line,EBV-LCL),應(yīng)用序列特異性引物PCR進(jìn)行HLA分型(由美國UAMS HLA實驗室完成)。選用HLA型別為HLA-A6801陰性的PBMC用于進(jìn)一步的實驗。

1.2.2 細(xì)胞染色及檢測 ①細(xì)胞準(zhǔn)備：收集HPV特異性的CTL及HLA-A6801陰性的PBMC,RP-5F調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/mL或4×107個/mL,使每一染色樣本中細(xì)胞總數(shù)為1×106。混合HPV特異性CTL及PBMC作為陽性標(biāo)本(CTL與PBMC比例約為95∶5)。單獨PBMC作為陰性標(biāo)本;②細(xì)胞染色及檢測：為探討在Tetramer用量及染色時間一定條件下,不同溫度對染色效果的影響,以及在溫度及染色時間一定條件下,不同Tetramer稀釋度對染色效果的影響,分別按表1和表2進(jìn)行細(xì)胞染色。

表1 探討溫度對染色效果的影響Table 1 To investigate the effect of temperature on staining

先加Tetramer于細(xì)胞懸液中,再加其他抗體,RP-5F補足體積為100μL,混勻,避光孵育30 min。PBS(含0.2%BSA,0.02%sodium azide)洗細(xì)胞3次,將細(xì)胞重懸于含1%for malin的PBS中,流式細(xì)胞儀Becton Dickinson FACSCalibur(BD Bioscience)檢測。每個樣本檢測1×105細(xì)胞,數(shù)據(jù)用Cell Quest軟件分析。Tetramer/CD8雙陽性的T細(xì)胞為HPV特異性的CTL細(xì)胞。

表2 探討Tetramer濃度對染色效果的影響Table 2 To investigate the effect of titration of Tetramer on staining

2 結(jié) 果

2.1 溫度對染色效果的影響

首先使用Tetramer-PE、anti-CD3-PerCP、anti-CD8-Alex及anti-CD45RO-APC進(jìn)行染色。參考N IH推薦,以1∶400稀釋的Tetramer染色30 min,比較3個不同溫度(4℃、室溫(約21℃)及37℃)的染色效果,以確定最佳的染色溫度。結(jié)果顯示,在3個溫度下,陽性標(biāo)本中HPV特異性CTL陽性的百分比相似,分別為0.27%、0.26%、0.23%,CD8-T細(xì)胞被非特異性染色的比率較低,分別為0.05%、0.05%、0.06%,見圖1。陰性標(biāo)本中非特異性染色均在0.01%以下,見圖2。為方便操作,選擇室溫(約20℃)為染色溫度,進(jìn)行后續(xù)的實驗。

2.2 Tetramer稀釋度對染色效果的影響

為排除可能發(fā)生非特異性結(jié)合的CD8-細(xì)胞,如單核細(xì)胞、CD4-T細(xì)胞、B細(xì)胞等,使用anti-CD4-FITC、anti-CD14-FITC、anti-CD19-FITC抗體進(jìn)行染色,并檢測CD4/14/19陰性區(qū)的PerCP、PE、APC熒光強度。在室溫染色30 min條件下,比較4個Tetramer稀釋度(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600)的染色效果,以確定最佳的Tet-ramer用量。結(jié)果顯示,4個Tetramer稀釋度條件下,陽性標(biāo)本中HPV特異性CTL均集中在高熒光強度區(qū)域,陽性百分比分別為1.88%、2.03%、1.89%、2.10%,CD8-T細(xì)胞被非特異性染色的比率分別為0.12%、0.05%、0.03%、0.02%,見圖3。陰性標(biāo)本中非特異性染色均在0.01%或以下,見圖4。結(jié)果表明Tetramer稀釋度為1∶1 600時,可獲得最佳特異性CTL染色效果,即染色的CTL熒光強度保持高水平,且非特異性染色少。

3 討 論

Tetramer技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種檢測抗原特異性T細(xì)胞的工具。其原理是基于T細(xì)胞上表位特異性受體(TCR)對抗原遞呈細(xì)胞(APC)/靶細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子-肽復(fù)合物的精確識別。Tetramer由1個分子的鏈親素與4個分子的生物素化MHC-抗原肽連接形成組成,能夠同時結(jié)合多個TCR,顯著提高其與特異性T細(xì)胞的親和力,從而大大提高了抗原特異性T細(xì)胞檢測的敏感性。自1996年Altman[5]首次應(yīng)用MHC-肽四聚體技術(shù)檢測H IV抗原特異性的CTL及其前體細(xì)胞以來,該技術(shù)作為直觀、定量檢測抗原特異性T細(xì)胞的工具,已成為定量檢測特異性CD8+T細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn),并廣泛用于病毒感染[4,6-7]、腫瘤[8]及自身免疫性疾病[9]的研究。

研究證實,對某一MHC-抗原肽復(fù)合體具有特異識別作用的CTL在外周血淋巴細(xì)胞中的比率很低,大多在1%以下[4,10-11]。對于僅感染局部的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞的HPV更是如此[4],因此檢測這些低頻率的特異性CTLs不僅需要有高敏感度的方法,如Tetramer技術(shù),還需要優(yōu)化染色條件,增加流式細(xì)胞儀檢測的目標(biāo)信號/噪音信號比,進(jìn)而獲得可靠的實驗結(jié)果。

本研究從2個方面優(yōu)化實驗條件：①使用目標(biāo)細(xì)胞群陰性的抗體,試驗選擇了anti-CD4-FITC、anti-CD14-FITC、anti-CD19-FITC,用以排除可能發(fā)生非特異性接合的單核細(xì)胞、CD4-T細(xì)胞、B細(xì)胞等;②選擇理想Tetramer的濃度和孵育溫度。通過檢測含有已經(jīng)證實為HPV16 E6 133-142表位特異性CTL的標(biāo)本,分析不同Tetramer稀釋度和不同孵育溫度條件下,Tetramer與特異性CTL表面TCR的結(jié)合情況,以確定最佳染色條件。結(jié)果表明,4℃、室溫(約20℃)及37℃條件下,Tetramer染色的敏感性和特異性無明顯差異,染色溫度對Tetramer與CTL的結(jié)合無明顯影響。此結(jié)果與查慶兵等[12]報道一致。Whelan JA等[13]研究發(fā)現(xiàn),包含不能引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的變異肽的Tetramer在4℃時能使CTL著色,但在37℃卻不能。Whelan認(rèn)為,4℃染色檢測到的T細(xì)胞可能與免疫反應(yīng)相關(guān)性小,因而建議在37℃染色,以提高CTL染色的特異性。以上表明,在進(jìn)行標(biāo)本染色前,應(yīng)進(jìn)行預(yù)實驗,根據(jù)具體情況選擇合適的染色溫度。

Tetramer稀釋度對染色影響結(jié)果顯示：當(dāng)Tetramer濃度不斷下降,HPV特異性CTL的染色熒光強度逐漸下降,同時CD8-T細(xì)胞的非特異性染色也逐漸減少,但HPV特異性CTL陽性率基本保持不變。本研究結(jié)果為進(jìn)一步檢測HPV感染后機體產(chǎn)生的抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)及研究疫苗的接種效果打下堅實的基礎(chǔ)。

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