虎奶菇菌絲體胞外多糖深層發酵培養基的優化

孟凡杰（農村成人高等?？茖W校，吉林 梨樹 136500）

虎奶菇［Pleurotus tuber-regium（Fr.）Sing］又名核耳菇，隸屬側耳科的菌核，生于森林內土中的腐木或木樁上，是產于熱帶、亞熱帶地區的一種珍稀食藥用菌，我國云南省滕沖、章風一帶有分布，滇西南一帶民間多從緬甸進口，資源十分緊缺。據《中藥藥名辭典》載：虎奶菌，甘，溫，補氣益血，治氣血虛弱癥。在東南亞國家華僑中及我國沿海地區，虎奶主要作為強壯補品食用，在一些民間處方中，為一味止咳平喘中藥。但虎奶菌作為一種中藥材在我國藥典和各地地方標準中并未被收載；目前在非洲的尼日利亞、加納、肯尼亞等正在引種栽培。福建三明也成功地引種栽培。據報道虎奶菇富含蛋白質、多糖等活性物質和鉀、鈣、鎂等礦質元素，具有較高的營養價值和藥用價值。非洲一些國家用虎奶菇治療胃病、糖尿病、冠心病、高血壓等疾??；虎奶菇還能促進胎兒發育，提高早產兒成活率；東南亞各國用虎奶菇菌核治療痢疾。據報道，虎奶菇菌核入藥，外敷有治療婦女乳腺炎之效。迄今我國尚未開發利用。由于虎奶菇人工栽培周期長、產量低、成本高，為了開發利用虎奶菇資源，從國外引種進行栽培和發酵培養的深入研究是十分必要的。已知從各種真菌中分離出具有生物活性的物質常為多糖［1-7］、靈芝多糖、灰樹花多糖等已用于腫瘤的臨床治療。經研究發現在虎奶菌核中多糖為其主要成分，占菌核干重的60％［8］。本文就虎奶菇菌絲體深層發酵培養基進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

虎奶菇：購于山東濟寧光大食用菌科研中心。

1.1.2 碳源

葡萄糖，果糖，木糖，麥芽糖，乳糖，蔗糖，玉米淀粉，馬鈴薯，糊精。

1.1.3 氮源

酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，豆粕粉，麩皮。

1.2 主要儀器設備

回轉式恒溫調速搖床柜（無錫查橋輕機廠）；超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；

立式圓形壓力蒸汽滅菌器（上海醫用核子儀器廠）；

80-2型離心機（上海器械廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基的配制

斜面培養基（PDA培養基）：馬鈴薯20g（煮沸20min過濾取濾液）、葡萄糖2g、瓊脂2g、水100g、pH值自然。

液體發酵培養基：馬鈴薯250g（切碎煮沸30min，用4層紗布過濾，取濾液），蔗糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，KH2PO41g，MgSO40.6g，水1000g，pH值自然。

1.3.2 培養方法

平皿培養：從母種試管中切出蠶豆大小的菌絲塊接種于培養皿的中部，于25℃培養7d。

液體種子培養：將已活化的平板菌定量接種于液體種子培養基中，500mL三角瓶裝培養基50mL，于25℃，150r/min搖瓶培養7d。

搖瓶條件實驗：在發酵優化培養基中接入液體種子，變化相應搖瓶條件進行實驗，分別測定菌體干重與胞外多糖量。

1.3.3 測定方法

菌體干重（Wd）：所得發酵液于3000r/min離心20min，去離子水洗滌后用sartrius自動水分干燥儀干燥至恒重。

總糖（Wts）：苯酚-硫酸法

胞外多糖（Wl）：發酵濾液多糖

2 結果與討論

由于虎奶菇在我國產量較少，引種栽培也剛剛起步，液體深層發酵培養更不成型，買的這株菌常規培養下產量就很不穩定，因此需要進行簡單優化。

2.1 碳源對菌絲生長及多糖產量的影響

圖1 不同碳源菌體干重和多糖含量

虎奶菇作為一種擔子菌，它對碳源的利用也應該相當廣泛，但是不同的碳源對菌絲生長及多糖產量的影響會很大。葡萄糖、果糖、麥芽糖和糊精等都是虎奶菇菌絲體較為理想的碳源，尤其以馬鈴薯和蔗糖為最佳，虎奶菇菌絲體在果糖中比在葡萄糖中生長要好，說明酮糖比醛糖更容易被虎奶菇菌絲體利用，這一結論也可以從蔗糖、麥芽糖的結果差異上得到證明，麥芽糖是以兩個葡萄糖為單位連接而成的雙糖，蔗糖則為葡萄糖和果糖組成的雙糖，結果虎奶菇菌絲體在以蔗糖作為碳源的培養基中菌絲生長量和多糖產量都高于麥芽糖。因此，綜合考慮采用蔗糖和馬鈴薯組成的復合碳源。

2.2 氮源對菌絲生長及多糖產量的影響

由于擔子菌使用無機氮作為氮源時，菌絲必須利用無機氮合成其需要的各種氨基酸，而某些氨基酸可能不能被菌體生物合成，從而影響菌絲的生長［22］。因此作者沒有選用無機氮，只選擇酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕粉和麩皮。結果表明除豆粕粉以外，其他四種氮源差別不大，用酵母膏時多糖產量略高一些，為0.521mg/mL，而用蛋白胨時菌體量略高一些，為1.003g/100mL，因此選用酵母膏和蛋白胨作為復合氮源較理想。使用豆粕粉為氮源時，產量非常低，這是作者沒有想到的。

2.3 正交試驗優化培養基組成

以上單因子實驗表明，蔗糖、馬鈴薯、酵母膏和蛋白胨是影響虎奶菇菌絲生長和多糖產量的主要營養因子。為考慮多因子的協同作用，并確定最適用量和配比，以得到經濟有效的虎奶菇菌絲體培養基組成，選用蔗糖、馬鈴薯、酵母膏和蛋白胨等四因子，各取三水平，進行正交試驗。

表1 正交試驗因素水平表L9（34）

極差分析表明，各因素對虎奶菇菌絲體干重的影響程度為：A＞B＞C=D，也就是說蔗糖是菌絲體生長的最主要因素（R=0.099），菌絲體生長理論上的最優組合為A3B1C1D2，即蔗糖3g/100mL，馬鈴薯20g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。對胞外多糖影響的最優組合為A2B3C2D2，即蔗糖2g/100mL，馬鈴薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。

由于培養虎奶菇菌絲體的目的為產多糖，結合投入與產出比，選擇碳氮源的配比為：蔗糖2g/100mL，馬鈴薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。

表2 正交試驗結果的極差分析

3 結論

虎奶菇多糖深層發酵的最佳培養基組成（g/L）為∶蔗糖2g/100mL，馬鈴薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。在此條件下發酵產虎奶菇胞外多糖達0.5mg/100mL以上。

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