小鼠胚胎干細胞移植后兩種示蹤方法的比較

關(guān)云謙，謝 淑，孫靜敏，鄒春林，陳 凌，張 愚

1首都醫(yī)科大學 宣武醫(yī)院 老年病研究所細胞治療室，北京 100053 2教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100053 3國家人類基因組北方研究中心，北京 100176 4空軍第三通信修理所衛(wèi)生所，北京 100075

小鼠胚胎干細胞移植后兩種示蹤方法的比較

關(guān)云謙1，2，謝 淑3，孫靜敏4，鄒春林1，2，陳 凌1，2，張 愚1，2

1首都醫(yī)科大學 宣武醫(yī)院 老年病研究所細胞治療室，北京 1000532教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 1000533國家人類基因組北方研究中心，北京 1001764空軍第三通信修理所衛(wèi)生所，北京 100075

目的觀察小鼠胚胎干細胞 (ES)移植入大鼠腦內(nèi)后綠色熒光蛋白 (GFP)質(zhì)粒和Thy-1抗體在指示細胞及細胞分化方面的特點。方法標記方法一:將p-EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ES細胞，連續(xù)10代抗生素篩選表達GFP的GFPES，并將GFP-ES移植入活體大鼠腦內(nèi)。取材后冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察切片上的綠色熒光。標記方法二:直接移植胚胎干細胞后取材，用特異性抗小鼠Thy-1抗體作移植細胞的免疫組織化學染色，熒光顯微鏡下觀察。另外，兩種標記方法均做神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的特異抗體神經(jīng)細胞核抗體 (NeuN)和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白 (GFAP)的免疫組織化學染色，觀察是否與GFP或Thy-1抗體雙標記，以此判定細胞分化情況。結(jié)果GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的ES細胞團和單細胞均表達亮綠色的GFP，轉(zhuǎn)化效率為30%;移植21d后，大鼠腦內(nèi)存活的移植細胞仍表達GFP，但不能和NeuN、GFAP的染色雙標記。大量Thy-1陽性的植入細胞和NeuN、GFAP雙標記。結(jié)論GFP質(zhì)粒標記胚胎干細胞后移植可以較好地顯示移植細胞，但不能觀察細胞分化;而Thy-1抗體不僅在顯示移植細胞上有較好的效果，還可以準確地標記分化細胞。

綠色熒光蛋白;胚胎干細胞;分化

干細胞移植治療常需要在體外對將要移植的細胞進行標記，使這些細胞植入及體內(nèi)分化后仍能攜帶標記，借此可以對其進行監(jiān)測。標記方法有多種，早期使用的有生物染料DiI等［1］，還有利用干細胞不斷增殖的特性，使其在復制過程中攝取一些放射性標記的堿基，例如H3-胸苷［2］，或堿基的類似物，例如5溴-2脫氧尿苷 (5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)［3］，再用同位素顯影或者抗體檢測的方法。但是，生物染料可能在植入細胞死亡后漏出，再被宿主細胞攝取形成假相;BrdU類方法的缺陷在于植入的細胞無論是否存活，都可以被檢測到。近年有學者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)基因轉(zhuǎn)入細胞，可以用熒光顯微鏡直接觀察［4］，還便于進行抗體雙標記鑒定細胞的分化情況;另一個明顯優(yōu)于BrdU類方法的特點是:只有活細胞才表達GFP，GFP熒光的存在表明植入的細胞在取材當時是活細胞。另一種在移植實驗中常采用的示蹤方法，即用特異性抗小鼠的抗體做植入細胞的標記，這樣的抗體有M2、Thy-1等。其中小鼠Thy-1抗原是在小鼠神經(jīng)細胞和T淋巴細胞特異性表達的抗原，本研究選取的抗小鼠Thy-1抗體與大鼠和人無交叉反應，而且大鼠腦組織中也無Thy-1抗原。所以抗小鼠Thy-1抗體可以用來做小鼠ES細胞分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的檢測［5-7］。本研究主要比較GFP標記和Thy-1染色兩種方法在鑒定小鼠ES細胞移植后的存活、分化等情況時的特點。

材料和方法

材料 小鼠ES細胞由Stanford大學Okada博士贈送。細胞培養(yǎng)器皿使用美國Falcon公司產(chǎn)品。細胞培養(yǎng)試劑購自美國GIBCO/BRL公司。PEGFP-N1質(zhì)粒購自美國CLONTECH公司。聚陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine)購自美國Invitrogen公司。免疫抑制劑環(huán)胞霉素A購自諾華制藥 (中國)有限公司。小鼠抗小鼠 Tuj-1(β-tubulin-Ⅲ)IgG抗體購自美國Promega公司，兔抗小鼠Thy-1購自美國Santa Cruz。質(zhì)粒DNA提取采用美國Promega公司的“Wizard PureFection”質(zhì)粒DNA純化系統(tǒng) (Wizard PureFection Plasmid DNA Purification System)。美國 Pharmagen公司GENETVX-MAC 8.0分光光度計。美國BIO-RAD公司激光共聚焦顯微鏡，型號MRC-1024。Nikon TE2000-U型倒置熒光顯微鏡，SPOT-RT冷卻式數(shù)字顯微攝像系統(tǒng)。

ES細胞培養(yǎng) 小鼠ES細胞在鋪有明膠的培養(yǎng)瓶中使用下述培養(yǎng)基培養(yǎng):DMEM、15%胎牛血清、100 mmol/L 非必需氨基酸、0.55 mmol/L β-巰基乙醇、L谷氨酸、青鏈霉素，使用前添加1 000 U/ml人類白血病抑制因子 (human leukemia inhibition factor，hLIF)。隔天換液，2～3 d后細胞長滿瓶底，按照1∶5 比例傳代［8］。

大腸桿菌中常規(guī)擴增pEGFP-N1質(zhì)粒 質(zhì)粒的提取按照“Wizard PureFection”質(zhì)粒DNA純化系統(tǒng)使用說明進行［9］。用GENETVX-MAC 8.0分光光度計測定質(zhì)粒DNA的濃度。

質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體共同轉(zhuǎn)化ES細胞 轉(zhuǎn)化前1 d，將5×105ES細胞傳代到25 cm2培養(yǎng)瓶，過夜培養(yǎng)后細胞貼壁。轉(zhuǎn)化之前，首先將3 μg GFP-DNA加入到1 ml去除血清和青鏈霉素的ES細胞培養(yǎng)基中(A管)，將18 μl脂質(zhì)體加入到去除血清和青鏈霉素的ES細胞培養(yǎng)基1 ml中 (B管)，將A、B管混合，輕柔搖勻，靜置30 min待脂質(zhì)體-DNA復合物形成，將普通ES培養(yǎng)基換成A、B管混合后形成的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜棄去，恢復普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中添加500 μg/ml G418。連續(xù)10代G418傳代培養(yǎng)。

細胞移植和組織處理 取健康雄性SD大鼠8只(購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所)，體重300～330 g。移植術(shù)前3 d到術(shù)后處死日每天按照10 mg/kg劑量腹腔注射免疫抑制劑環(huán)胞霉素A。移植的細胞采用轉(zhuǎn)化后第10～12代、傳代后24 h、處于對數(shù)生長期的GFP-ES，將胰酶消化后打散的GFP-ES細胞以 (5～6)×107/ml密度移植。將大鼠麻醉后固定在立體定位儀上，以前囟為坐標原點，按照以下位置:前囟向后2 mm，旁開3.5 mm，深5 mm(尾殼核)，用微量進樣器植入 (2.5～3) ×105個 ES細胞 (5 μl)，植入速度為1 μl/min，植入完畢后留針5 min［10］。動物飼養(yǎng)21 d后深麻醉處死，100 ml生理鹽水、300 ml 4%多聚甲醛經(jīng)心灌注固定取腦，腦組織經(jīng)后固定、梯度蔗糖脫水后液氮速凍，注射針孔前2.0 mm到后2.0 mm連續(xù)20 μm冰凍切片，10%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

免疫組織化學檢測 將冰凍切片用0.01 mol/L PBS洗滌，1%Triton X-100孵育4℃過夜，PBS洗滌，羊血清封閉30 min，1∶400鼠抗鼠神經(jīng)細胞核(neuronal nuclei，NeuN)，1∶400 鼠抗鼠膠質(zhì)原纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein，GFAP)一抗4℃過夜，PBS洗滌，羊抗兔 Texas Red熒光二抗避光孵育2 h，PBS洗滌，10%甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

激光共聚焦顯微鏡斷層掃描 油鏡 (×100)對視野中的綠色細胞進行掃描，參數(shù)設置如下:激發(fā)光波長:綠色光488 nm，紅色光596 nm。

細胞雙標比例計數(shù) 在每只大鼠約200張切片中選擇第75～125張，每隔5張取2張切片，分別做GFP和NeuN抗體、GFAP抗體的免疫雙標記染色，以及Thy-1和NeuN、GFAP的免疫熒光雙標記染色。每張切片在紋狀體區(qū)隨機選取10個視野。在熒光顯微鏡下計數(shù)與GFP雙標的、同時表達NeuN、GFAP的細胞占GFP陽性細胞的比例，以及與Thy-1雙標記的NeuN、GFAP陽性細胞占Thy-1陽性細胞的比例。

結(jié) 果

GFP-質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物轉(zhuǎn)化 ES細胞過夜后，第2天即可見到大量細胞表達GFP，熒光顯微鏡下無論是細胞團還是散在細胞均為亮綠色 (圖1A)。隨機選取1 000個細胞進行計數(shù)，對比表達綠色熒光的細胞和光鏡下 (圖1B)可見的細胞數(shù)量，結(jié)果30%～40%的細胞表達GFP熒光。向培養(yǎng)基添加500 μg/ml G418后，部分未轉(zhuǎn)化的細胞死亡。

攜帶GFP的ES植入活體大鼠腦組織后，經(jīng)過21 d，在全部8只大鼠的注射位點針道周圍2 mm范圍內(nèi)均可看到移植入的細胞表達亮綠色的GFP，可以和宿主本身的組織清晰地區(qū)別開來 (圖2A)。利用激光共聚焦顯微鏡進行斷層掃描，可以清楚地計數(shù)每一層的細胞數(shù)量 (圖2B)。注射位點的綠細胞仍然聚集存在，距離注射位點越遠，綠細胞的數(shù)量逐漸減少。免疫組織化學結(jié)果顯示，移植針道周圍有密集的表達Tuj-1(紅色)的神經(jīng)元 (圖2A)。與此相對應，Thy-1抗體的熒光和NeuN或者GFAP的熒光重合較好，移植細胞所表達的Thy-1綠色熒光和NeuN(圖3A、B、C)、GFAP(圖3D、E、F)表達的紅色熒光可以較好地重合。經(jīng)過雙標記細胞計數(shù)可以得出，與Thy-1雙標記的NeuN、GFAP陽性細胞占Thy-1陽性細胞的79%～90%和16%～28%。

討 論

干細胞因其具有較強的增殖能力可以解決移植所需要的細胞數(shù)量的問題，同時具有分化的全能性，可以分化成為多種組織細胞，所以被認為在治療嚴重的組織損傷、退行性變等疾病中具有潛在應用價值［11］。利用ES細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，例如帕金森病、脫髓殼疾病等方面已經(jīng)取得了較好的效果［12-13］，這些研究工作的開展需要對移植細胞進行有效的標記。

GFP標記干細胞是一種較好的方法，將GFP基因轉(zhuǎn)入干細胞的常用載體有病毒和質(zhì)粒兩種。使用病毒給ES細胞標記GFP可以形成穩(wěn)定的表達，但是病毒轉(zhuǎn)染需要的實驗條件比較復雜。質(zhì)粒標記的優(yōu)點是簡便有效，不足之處是轉(zhuǎn)染效率低。質(zhì)粒標記為不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，理論上質(zhì)粒DNA能使0.001%～1%的細胞形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，pEGFP-N1質(zhì)粒所轉(zhuǎn)入的GFP基因上連接有G418(新霉素)抗性基因，連續(xù)抗生素傳代培養(yǎng)后可以形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細胞株。但是本研究小鼠ES細胞移植前經(jīng)過連續(xù)10～12代500 μg/ml G418培養(yǎng)尚不足以形成穩(wěn)定的GFP-ES細胞株，只能保持60% ～70%的細胞表達GFP。

移植實驗證實植入活體大鼠尾殼核的細胞經(jīng)過3周后，熒光顯微鏡下可以直接觀察到仍有多量細胞表達GFP，可以方便地進行這些區(qū)域存活細胞計數(shù)。具體到細胞分化情況，在移植區(qū)域表達GFP的細胞周圍聚集存在多量表達Tuj-1的細胞，但對側(cè)尾殼核并不存在，所以這些表達Tuj-1的神經(jīng)元應當來自移植細胞，Thy-1抗體和Tuj-1、GFAP的雙標記也證明了這一點。未發(fā)現(xiàn) GFP熒光與 Tuj-1、NeuN或者GFAP的重合，表明這些分化的植入細胞不再表達GFP，原因可能是分化了的細胞是移植前未被GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入的細胞，也可能由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)入過的細胞分化以后丟失了GFP。所以質(zhì)粒標記可以用于觀察細胞是否能夠經(jīng)過移植操作后存活下來的實驗，但不能有效地說明ES細胞的分化情況。

Thy-1又稱為CD-90，是一種特異性地在小鼠T淋巴細胞和神經(jīng)細胞中表達的糖蛋白。五步法細胞分化實驗證實，小鼠胚胎干細胞分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞前均不表達Thy-1，而分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞后Thy-1才和神經(jīng)元特征性的抗原NeuN、星形膠質(zhì)細胞特征性抗原GFAP雙標記。小鼠ES細胞腦內(nèi)移植實驗證實，表達神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞標志抗原的細胞同時表達Thy-1，證明了這些移植細胞分化成為了神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。結(jié)合體內(nèi)和體外實驗可以看出，Thy-1對小鼠胚胎干細胞分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞可以特異性地顯示，但其對于分化成為神經(jīng)細胞前的各個細胞階段均不能有效示蹤。

綜上，通過GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞和分化后用特異性抗體顯示移植細胞兩種方法各有優(yōu)缺點，適當?shù)貙@兩種方法進行選擇，可以實現(xiàn)對移植細胞的有效標記。

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小鼠胚胎干細胞移植后兩種示蹤方法的比較

圖1 p-EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小鼠胚胎干細胞 (×200)Fig 1 Transfection of mouse embryonic stem cell with p-EGFP-N1 plasmid(×200)

圖2 經(jīng)GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的胚胎干細胞移植后21d的免疫組織化學染色Fig 2 Immuno-staining of pEGFP-N1 plasmid transfected mouse embryonic stem cells 21 days after transplantation

小鼠胚胎干細胞移植后兩種示蹤方法的比較

Comparison of Two Tracing Method of Transplanted Mouse Embryonic Stem Cell

GUAN Yun-qian1，2，XIE Shu3，SUN Jing-min4，ZOU Chun-lin1，2，CHEN Ling1，2，ZHANG Yu1，2

1Department of Cell Therapy，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China2Key Lab of Neurodegenerative Diseases of Education Ministry，Beijing 100053，China3Chinese National Human Genome Center，Beijing 100176，China4Health Center of the Third Communication Device Repair Shop of Air Force，Beijing 100075，China

CHEN Ling Tel:010-83198852，E-mail:chlyz34@163.com

ObjectiveTo trace the embryonic stem(ES)cells transplanted into rat brain by labeling the cells with green fluorescent protein(GFP)and by mouse neuronal specific antibody Thy-1 and compare their features.MethodsFor GFP labeling，transfect pEGFP-N1 plasmid containing GFP and anti-neomycin sequences into embryonic stem cell and add neomycin for more than 10 passages.To test the GFP expressionin vivo，the GFP-ES was transplanted into healthy rat brain，and the frozen sectioned slides wereobserved under fluorescence microscope and laser con-focal microscope 21 days later.For the amtibody labeling，embryonic stem cells were directly transplanted into the rat brain.The specific mouse thy-1 antibody was used in immunostaining of transplanted cells.For both of the two labeling method，the slides were also examined by double labeling with the antibodies，neuronal nuclei(NeuN)or glial fibrillary acidic protein(GFAP)to identify the differentiation of transplanted cells.ResultsBoth single ES cell and cell pellets expressed bright green fluorescence the day after plasmid transfection，and more than 30%ES cells were labeled.The GFP-labeled cells could still be found gathered around the infusion channel at least 21 days later，but the GFP fluorescent could not be overlapped with NeuN or GFAP staining.On the contrary，Thy-1 antibody overlapped well with NeuN or GFAP staining.Conclusions Liposome-helped plasmid GPF transfection is effective in labeling mouse embryonic stem cellin vivo，but is not effective in showing the differentiated cells.On the contrary，Thy-1 antibody can not only show the transplanted cells，but also trace the transplanted cells after their differentiation.

green fluorescent protein;embryonic stem cell;differentiation

Acta Acad Med Sin，2010，32(4):445-448

陳 凌 電話:010-83198852，電子郵件:chlyz34@163.com

Q2-33

A

1000-503X(2010)04-0445-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2010.04.019

(本文圖1～3見插圖第4、5頁)

2009-06-29)

國家自然科學基金 (30940039，30970939)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (2006CB943703)和北京市科委科技計劃(H020220010290)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30940039，30970939)，National Basic Research Program of China(973 Program)(2006CB943703)，and Scientific Project of Beijing Municipal Science＆ Technology Commission(H020220010290)

圖3 Thy-1抗體顯示胚胎干細胞移植入正常大鼠腦內(nèi)21d后的分化 (×200)Fig 3 Differentiation of mouse embryonic stem cells identified by Thy-1 antibody 21 days after transplantation into normal rat brain(×200)

·短篇論著·