麻蠅胞漿全蛋白質提取與純化研究

摘要:使用醇提、水提、鹽提、堿提獲得麻蠅胞漿全蛋白，電泳結果蛋白條帶清晰，蛋白含量較高，蛋白質大小位于10~82 kD。該方法適合于麻蠅胞漿蛋白質組學研究中純化總蛋白質，通過家蠅幼蟲蛋白質提取過程的研究，為其它昆蟲或動物蛋白提取提供了一個可行的實驗依據。

關鍵詞:麻蠅;蛋白質;純化; 硫酸銨;電泳

中圖分類號:S852.74+3文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.05.008

Study on Extraction Methods of the Total Protein of Flesh Fly

ZHU Yan-ping， CHEN Wei-hua

(Life College，Jiangxi Normal University，Nanchang，Jiangxi 330022，China)

Abstract:The whole cytoplasmic protein was gotten by using of ethanol， water， salt and alkali. The result of SDS-PAGE showed that protein bands were clear and with higher protein， and the molecular weight was 10~82 kD. The method was suitable for plasma proteomics Sarcophagidae total protein purification， and it was a good experimental evidence of studying for other insect or animal protein extraction.

Key words: flesh fly; protein; purification; ammonium sulfate; electrophoresis

麻蠅(flesh fly )是雙翅目麻蠅科昆蟲[1]。據國內外對蠅蛆營養成分的分析，蠅蛆(干物質)含粗蛋白54%～60%[2-3]，脂肪10%~14%，甲殼素8%～10%[4]和多種維生素、微量元素等營養成分，是一個營養豐富的飼料蛋白資源。根據家蠅生長周期，利用它的最好階段應該是其幼蟲期。我們通過探索麻蠅胞漿蛋白質的提取制備，進一步開發利用和對其它昆蟲幼蟲或成蟲蛋白質的提取，將起到一定的借鑒作用。

1材料和方法

1.1材料

麻蠅胞漿(提供)。

1.2主要儀器

索式提取器;高速冷凍離心機;721型分光光度計。

1.3主要藥品

標準蛋白 Marker;硫酸銨;SDS;考馬斯亮藍;Tris-HCl;溴酚藍 (均為分析純)。

1.4方法

1.4.1考馬斯亮藍測定蛋白的標準曲線制作[4] 根據Braford法，用牛血清蛋白做標準曲線得出樣品蛋白濃度，制作標準曲線:0~100 μg/mL標準曲線制作，取10支10 mL干凈的試管，按表1取樣，將各試管中溶液混勻，放置2 min后用1 cm光經的比色杯在595 nm波長下比色，記錄各試管測定的光密度OD 595 nm。

1.4.2胞漿的處理(1)將冷凍蠅蛆緩凍后，用勻漿器充分勻漿，置于55 ℃烘干箱內烘干。(2)在索式提取器內使用乙醚抽提脂肪。

1.4.3醇溶蛋白提取取0.1 g去脂后的樣品，加入5 mL無水冷乙醇，混勻后10 000 r/min離心15 min，得沉淀，置4 ℃冰箱自然晾干[5]。

1.4.4胞漿蛋白的提取取0.1 g去脂后的樣品，加入5 mL水，在4 ℃下提取10 h，4 000 r/min離心15 min，得上清液，殘渣再次用2.5 mL水混勻提5 h，再次離心，兩上清液合并，于4 ℃環境下保存。

1.4.5硫酸銨沉淀蛋白質以溫度、時間、硫酸銨濃度和鹽析時間為試驗因素，采用L25(54)進行正交試驗(表2)，以所得蛋白質含量為標準確定最優條件[6]。將獲得的蛋白質沉淀用少許蒸餾水溶解，過G-25層析柱脫鹽。

1.4.6鹽溶性蛋白質提取在經過蒸餾水提取后的剩余物中加入10%的氯化鈉溶液，攪拌離心，取上清液，重復提取3次，合并上清液。

1.4.7堿溶蛋白提取在經過氯化鈉提取后的剩余物中依次加入2%的氫氧化鈉，提取蛋白。

1.4.8電泳將上述樣品分別過G-25脫鹽后用15%的分離膠進行電泳[7]。

2結果與分析

2.1考馬斯亮藍測定蛋白的標準曲線

將各管在OD595 nm比色，可測定各管的OD值，根據其測定值可繪制出如圖1標準曲線。

上圖標準曲線得出的公式y = 121.38x-4.674 9，R2 = 0.994 4。

2.2硫酸銨沉淀蛋白質正交試驗

由正交試驗可知，麻蠅胞漿蛋白質提取工藝的參數以5 ℃、pH4、硫酸銨濃度80%、時間5 h所提取的蛋白質得率最高。

2.3SDS電泳結果

由電泳結果(圖2)可以看出麻蠅胞漿蛋白質，，水不溶性蛋白質含量較少，水溶及醇溶性蛋白質含量較多。將上述幾種方法的綜合能夠較理想的獲得麻蠅胞漿全蛋白。

參考文獻:

[1] 王芙蓉.家蠅幼蟲組織勻漿液的抗病毒活性[J].昆蟲知識，2006，43(1):82-85.

[2] 郭源梅，田琪.家蠅蛋白的開發利用[J].獸藥與飼料添加劑，2000(6):35-36.

[3] 李廣宏，鐘昌珍，宗良炳，等.蠅蛆蛋白粉的營養評價[J].昆蟲知識，1997，34(6):347-350.

[4] 向洋，徐向麗.家蠅幼蟲蛋白質提取及純化工藝研究[J].長沙電力學院學報，1999，14(1):68-69.

[5] 王芙蓉，黃文，王艷麗，等. 家蠅幼蟲活性蛋白組分的提取及清除羥基自由基活性研究[J].昆蟲知識， 2005，42(5):546-549.

[6] 李春喜，王志和，王文林.生物統計學[M].北京:科學出版社，2002.

[7] 張龍翔.生化實驗方法和技術[M].北京:人民教育出版社，1982.