多功能柱凈化柱后電化學(xué)衍生法檢測花生中的黃曲霉毒素

摘要：建立了多功能凈化柱(MFC)凈化-高效液相色譜法測定花生中黃曲霉毒素的方法，試樣經(jīng)乙腈-水提取，稀釋，經(jīng)多功能柱凈化后進(jìn)行檢測，方法的檢出限為0.2 μg·kg-1，檢測限為0.5 μg·kg-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差5.28%~9.56%，回收率85%~110%。該方法操作簡便、準(zhǔn)確，回收率高、精密度良好、重現(xiàn)性好，能夠滿足歐盟對花生黃曲霉毒素檢測的限量要求。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素；多功能柱；電化學(xué)衍生；高效液相色譜

中圖分類號：S565.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2010.06.006

Development of a Method to Determine Aflatoxins in Peanut with Multifunctional Column Clean-up and HPLC Determination

CHEN Chang-fa1， WAN Shu-bo2， BAO Lei3， CHEN Xin1， LV Ning2， WU Xing-hai3

(1.Qingdao Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau ， Qingdao， Shandong 266001， China;2.Shandong Agriculture Science Institute， Jinan， Shandong 250100， China;3 Shandong Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao， Shandong 266001， China)

Abstract：A method for determination of aflatoxins in peanut was established. Samples were extracted by acetonitrile-water， solution. After dilution the extracts， flowed through a multifunctional column. The LOD of this method was 0.2 μg·kg-1， and the LOQ is 0.5 μg·kg-1. The recoveries of aflatoxins were 60%~95%， and the relative standard deviations were 3.72%~6.40%. The method is simple， rapid， accurate and applicable for the determination of aflatoxins in peanuts for EN.

Key words: aflatoxin; multifunctional column; electrochemical derivative; HPLC

黃曲霉毒素（Aflatoxin， AF），是黃曲霉和寄生曲霉等幾種真菌在代謝過程中產(chǎn)生的二次產(chǎn)物[1]。黃曲霉毒素已證實有17種衍生物，其中最為重要的包括B1、B2、G1、G2、M1等5種。黃曲霉毒素是一種毒性很強(qiáng)的肝毒素，還具有致癌性，黃曲霉毒素B1被認(rèn)為是致癌力最強(qiáng)的天然物質(zhì)[2-3]。鑒于黃曲霉毒素對人類的健康造成的危害，世界上許多國家已建立了AFT 的限量標(biāo)準(zhǔn)，其中歐盟對供人類直生活消費品中的AFB1含量要求小于2 μg·kg-1，總量小于4 μg·kg-1[4]。 目前，我們所采用的檢測方法或者靈敏度不高、操作煩瑣， 或者檢測速度較慢、檢測成本偏高。因此，本研究建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、簡單的檢測方法，以適應(yīng)出入境檢驗檢疫事業(yè)的需要。

1 材料和方法

1.1試劑與儀器

水為重蒸去離子水；甲醇：分析純，用于流動相的為色譜純；乙腈：色譜純；溴化鉀：分析純；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：黃曲霉毒素混合液（美國biopure公司）B1、G1：2.0 μg·mL-1，B2、G2：0.5 μg·mL-1，溶于乙腈中；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要準(zhǔn)確移取適量的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以流動相稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。均質(zhì)器：T-25德國ULTRA-TURRAX；多功能凈化柱（MFC）：Mycosep#226，美國ROMER LABS；高效液相色譜儀：Agilent1100，四元泵，自動進(jìn)樣器，HP1100化學(xué)工作站配備熒光檢測器；柱后衍生裝置：Kobra Cell，荷蘭LAMERS公司。

1.2試驗方法

1.2.1樣品提取取25.0 g粉碎樣品于250 mL三角燒瓶中，加入100 mL乙腈/水（84+16，V/V）提取液。以均質(zhì)器高速攪拌3 min，靜置過濾。

1.2.2MFC柱凈化吸取約5 mL濾液加入MFC柱的試管中，將MFC柱套管套入試管內(nèi)。緩慢將套管推至試管底部，使提取液通過MFC柱進(jìn)入套管中。從套管內(nèi)準(zhǔn)確移取1.0 mL凈化液至5 mL棕色小瓶中，于50 ℃下以氮氣吹干。準(zhǔn)確加入0.5 mL流動相定容，過0.45 μm濾膜供HPLC分析用。

1.2.3HPLC測定將上述黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液及樣液，按1.3所示色譜條件，以程序進(jìn)樣方式分析，化學(xué)工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3色譜條件

色譜柱：Lichrospher 100，RP-18，5 μm，125×4 mm；流動相：水+乙腈+甲醇（70+15+15，V+V+V），每1 L流動相加入119 mg KBr及100 μL濃硝酸供衍生用；流速：1 mL·min-1；熒光檢測器激發(fā)波長：360 nm，發(fā)射波長：440 nm；進(jìn)樣量：100 μL；Kobra Cell工作條件：電流100 μA。

2結(jié)果與討論

2.1凈化方法的選擇與提取體系的優(yōu)化

多功能柱是一種特殊的固相萃取柱（SPE柱）。它突破傳統(tǒng)的工作模式，以極性、非極性及離子交換等幾類基團(tuán)組成填充劑，可吸附樣液中的脂類、蛋白質(zhì)、糖類等各類雜質(zhì)，待測組分黃曲霉毒素不被吸附而直接通過，從而一步完成凈化過程，減少了傳統(tǒng)凈化方式如免疫親和柱凈化淋洗雜質(zhì)和洗脫待測樣的步驟，與國際流行的免疫親和柱相比，凈化效果同樣理想，凈化成本降低，如圖1所示。

本研究對提取體系進(jìn)行了優(yōu)化選擇。分別選用乙腈/水（84+16，V/V）、甲醇/水（6+4，V/V）兩種提取溶劑；2∶1和4∶1兩種比例的溶劑/試樣比（mL·g-1）；振蕩與高速均質(zhì)兩種提取方式進(jìn)行了試驗，結(jié)果顯示以乙腈/水（84+16）作為提取劑，以4∶1的溶劑/試樣比，以高速均質(zhì)3 min為提取方式的提取體系效果最為理想。

2.2衍生化方法的選擇

目前，國際上流行高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測器測定AF，為解決AFB1、G1熒光信號太弱的問題，一般采用柱前（Pre-column）加酸（如三氟乙酸TFA或鹽酸）或柱后加碘，將AFB1、G1衍生為熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的AFB2α和AFG2α，這些方法具有衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，操作繁瑣，不利于批量樣品快速檢測的缺點[5-6]。電化學(xué)衍生裝置Kobra Cell[7]，是利用電化學(xué)原理，將流動相中的KBr在電流作用下被還原產(chǎn)生Br2，后者可與AFT B1、G1反應(yīng)，產(chǎn)生溴化物使其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，此反應(yīng)在常溫下4 s內(nèi)完成，衍生效果非常理想，由于衍生反應(yīng)在線發(fā)生，解決了衍生物的穩(wěn)定性問題。試驗證明，該裝置對黃曲霉毒素的衍生效果十分理想，如圖2所示。

2.3檢測方法的選擇與改進(jìn)

高效液相色譜法配以熒光檢測器是檢測黃曲霉毒素的常用方法，具有靈敏度高、檢測限低等優(yōu)點。但經(jīng)典HPLC法大多采用液-液萃取（LLE）等作為凈化方法，不僅耗時長，而且由于凈化效果不佳而導(dǎo)致雜質(zhì)干擾。我們采用MFC凈化柱，凈化操作一步完成，凈化效果與目前國際采用的免疫親和柱[8]相比同等理想，結(jié)合電化學(xué)衍生裝置Kobra Cell，衍生反應(yīng)在線發(fā)生，衍生快速、理想，進(jìn)一步縮短了檢測的時間，提高了工作效率。

2.4檢出限和檢測限

經(jīng)確定，本方法的檢出限為0.2 μg·kg-1，檢測限為0.5 μg·kg-1。這一數(shù)值遠(yuǎn)低于歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)（B1<2 μg·kg-1，總量B1+B2+G1+G2<4 μg·kg-1〉因此，本方法足以滿足歐盟檢測需要。

2.5線性

移取適量的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(B1、G1：2.0 μg·mL-1，B2、G2：0.5 μg·mL-1)，以流動相稀釋成5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別是：（1）B1，G1：2.5 ng·mL-1，B2，G2：0.625 ng·mL-1；（2）B1，G1：5.0 ng·mL-1，B2，G2：1.25 ng·mL-1；（3）B1、G1：10 ng·mL-1，B2、G2：2.5 ng·mL-1；（4） B1、G1：15 ng·mL-1，B2、G2：3.75 ng·mL-1；（5） B1、G1：20 ng·mL-1，B2、G2：5.0 ng·mL-1。以程序進(jìn)樣方式，按1.3所述色譜測定方式，建立5點的校準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，4種黃曲霉毒素均顯示線性良好。分別為：AFG2：Y=48.37X + 1.20，r=0.996 0；AFG1：Y=43.12X+1.19，r=0.999 8；AFB2:Y=93.36X+0.29，r=0.999 1；AFB1:Y=49.84X +3.00， r=0.998 9。保留時間分別為：AFG2：3.86 min；AFG1:4.66 min；AFB2:5.32 min； AFB1: 6.50 min。

2.6方法回收率

本方法的回收率試驗是在未檢出黃曲霉毒素的花生仁和花生果中，添加黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為如下。1水平為B1：1.0 μg·kg-1、B2：0.25 μg·kg-1 、G1：1.0 μg·kg-1、G2：0.25 μg·kg-1；2水平為B1：2.0 μg·kg-1、B2：0.5 μg·kg-1、G1：2.0 μg·kg-1、G2：0.5 μg·kg-1；3水平為B1：8.0 μg·kg-1、B2：2.0 μg·kg-1、G1：8.0 μg·kg-1、G2：2.0 μg·kg-1。共3水平，每水平進(jìn)行2次平行試驗。各組回收率結(jié)果為AFB1：85.3% ~96.5%；AFB2： 87.0%~98.0%；AFG1：91.8%~110%；AFG2：90.0% ~110.0%。

2.7方法精密度

本方法的精密度試驗是在未檢出黃曲霉毒素的花生仁中，添加黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為如下。1水平為B1：1.0 μg·kg-1、B2：0.25 μg·kg-1 、G1：1.0 μg·kg-1、G2：0.25 μg·kg-1；2水平為B1：2.0 μg·kg-1、B2：0.5 μg·kg-1、G1：2.0 μg·kg-1、G2：0.5 μg·kg-1；3水平為B1：8.0 μg·kg-1、B2：2.0 μg·kg-1、G1：8.0 μg·kg-1、G2：2.0 μg·kg-1。共3水平、每水平進(jìn)行10次平行試驗，各組相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為：AFB1：5.28%~6.46%；AFB2：7.68%~8.01%；AFG1：4.69%~7.79%；AFG2：7.21%~9.56%。

3結(jié)論

采用多功能柱凈化結(jié)合柱后電化學(xué)衍生高效液相色譜法，檢測花生中的黃曲霉毒素B1、B2 、G1 、G2，方法的檢出限為0.2 μg·kg-1，檢測限為0.5 μg·kg-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差5.28%(9.56%，回收率85%~110%。該方法采用多功能凈化柱吸附試樣中的雜質(zhì)，凈化操作一步完成，與電化學(xué)衍生、高效液相色譜法結(jié)合使用，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、自動化程度高等優(yōu)點，完全滿足出入境工作中大批量花生樣品的檢測需要。

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