洋蔥查爾酮合成酶基因的分子克隆和表達分析

摘 要:查爾酮合成酶是類黃酮類物質合成的關鍵酶。本研究克隆了洋蔥的查爾酮合成酶基因AcCHS1和AcCHS2。AcCHS1的ORF序列 1 182 bp，編碼393個氨基酸殘基;AcCHS2的ORF序列1 176 bp，編碼391個氨基酸殘基。在同等條件下，AcCHS2基因的表達明顯高于AcCHS1。

關鍵詞:洋蔥;類黃酮;查爾酮合成酶基因;基因克隆;基因表達

中圖分類號:Q785 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)05-0001-04

洋蔥(Allium cepa L.)是百合科蔥屬二年生草本植物，是類黃酮含量較高的蔬菜種類之一，別名洋蒜、圓蔥、蔥頭等。它以肥大的肉質鱗莖為產品，根據其皮色可分為紅皮、黃皮和白皮等品種[1～3]。它是世界上重要的蔬菜作物，歐美國家譽之為“菜中皇后”。 洋蔥具有適應性強、耐貯運、供應期長、產量高、效益好等特點，不僅可以鮮食，而且還是很好的加工原料，已成為我國主要的出口創匯蔬菜之一[4]。

類黃酮(flavonoids)是自然界中存在的酚類物質，屬植物次級代謝產物。它具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值，對人體健康有重要影響，在防治心腦血管疾病、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗過敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[5]。因此生物類黃酮已引起國內外學者的廣泛關注， 成為研究開發的熱點。

類黃酮系色原烷或色原酮的衍生物， 其基本骨架具有C6-C3-C6 的特點， 即由兩個芳香環A和B， 通過中央三碳鏈相互連結而成的一系列化合物。其生物合成前體為丙二酰CoA 和對香豆酰CoA，由查爾酮合成酶(Chalcone Synthase，CHS)催化二者形成查爾酮，再在查爾酮異構酶(Chalcone Isomerase，CHI)催化下，使查爾酮的中央三碳鏈和氧形成閉合的C環。可見查爾酮合成酶是類黃酮基本骨架形成的第一個關鍵酶[6，7]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以洋蔥的新鮮葉片和花為材料，采自山東省農業科學院蔬菜研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80℃保存備用。

1.2 RNA提取

洋蔥的總RNA用RNAsimple總RNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，cDNA 第一鏈的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen，北京)完成。

1.3 PCR反應

本研究所用的一組引物P1: 5′-CATGTCCAAGATCAACATCGATGAG-3′和P2: 5′-CAATCCCGAACGCACCCATTAACA-3′以及另一組引物P3: 5′-CACTACACTTAACTGAACCATGTC-3′和P4: 5′-CCTAACCATCAATGGCCACACT-3′，由博尚生物技術有限公司合成。

PCR反應總體積為25 μl，其中模板cDNA 1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，引物各0.5 μl，10×Ex-Taq buffer 2.5 μl，Ex-Taq DNA polymerase(Takara，大連)0.13 μl，用滅菌蒸餾水補充至25 μl。擴增程序:94℃預變性4 min;94℃變性30 s，58℃退火 1 min，72℃延伸1 min 30 s，35個循環;最后72℃保溫8 min。

1.4 目的片段的克隆

擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在凝膠成像系統上檢測并照相記錄，分子量Marker DL2000從大到小依次為:2000、1000、750、500、250和100 bp。

PCR 擴增產物用凝膠回收試劑盒(Tiangen，北京)進行回收，與克隆載體pMD18-T(Takara，大連)連接，轉化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆送到博尚生物技術有限公司進行測序。

1.5 序列分析

序列比對在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進行。生物信息學分析主要采用DNAMAN 軟件及http://www.expasy.org 、http://www.softberry.com/等鏈接的網上軟件進行。

1.6 基因表達半定量分析

用AcTublin作為內標，所用上游引物為5′-CCATCTCCTCAGGTCTCAACTTC-3′，下游引物為5′-CGCTTCGTCTTTATTGTCGCCA-3′。通過PCR產物條帶的亮度調整模板cDNA的濃度，使其達到一致。然后再用基因特異引物進行擴增，PCR循環25～30次，對電泳結果進行記錄和分析。

2 結果與分析

2.1 洋蔥AcCHS1和AcCHS2基因的克隆

洋蔥 RT-PCR 產物經電泳分離(圖1)，再通過回收、連接、轉化后，經藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆進行序列測定。對其中一條序列進行ORF分析，發現有完整的開放讀碼框，其ORF序列1 182 bp，預測的蛋白質由393個氨基酸殘基組成，將其命名為AcCHS1基因。對另一條序列進行ORF分析，發現其ORF序列1 176 bp，預測其編碼的蛋白質由391個氨基酸殘基組成，將其命名為AcCHS2基因。

洋蔥AcCHS1和 AcCHS2基因的堿基序列相似性達到78.43%(圖2)。與網上洋蔥EST庫進行序列比對，結果AcCHS1基因對應1條EST，AcCHS2基因對應8條EST。

2.2 洋蔥AcCHS1和AcCHS2基因編碼蛋白的特征

將洋蔥AcCHS1基因和AcCHS2基因預測的編碼蛋白與模式植物水稻和擬南芥的CHS蛋白進行序列相似性比較(圖3)。結果顯示它們的部分區域很保守，保留了所有的高度保守的催化活性中心氨基酸殘基(半胱氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、天冬酰胺):AcCHS1 蛋白的Cys166、Phe217、His305、Asn338和AcCHS2蛋白的Cys164、Phe215、His303、Asn336。

用Signal P3.0 Server 檢測，結果顯示AcCHS1和 AcCHS2蛋白不含信號肽序列，為非分泌蛋白。采用SOPMA 進行二級結構預測，結果表明，AcCHS1 蛋白二級結構主要由α-螺旋(Alpha helix，40.97%)和隨機卷曲(Random coil，34.86%)以及延伸鏈(Extend strand，17.05%)和β-轉角(Beta turn，7.12%)組成。AcCHS2蛋白二級結構主要由α-螺旋(Alpha helix，42.46%)和隨機卷曲(Random coil，33.50%)以及延伸鏈(Extend strand，17.14%)和β-轉角(Beta turn，6.91%)組成。說明兩者的蛋白二級結構非常相似。

2.3 CHS編碼蛋白的進化樹分析

將洋蔥的查爾酮合成酶蛋白與擬南芥、大豆和高粱的查爾酮合成酶蛋白進行聚類分析。擬南芥基因組只有一個CHS基因，而在大豆和高粱基因組中CHS是多基因家族。結果(圖4)單子葉植物洋蔥和高粱聚成一個類群，雙子葉植物擬南芥和大豆聚成一個類群。并且洋蔥、大豆和高粱的CHS重復基因，都是一個物種內的基因聚在一起。

2.4 洋蔥AcCHS1和AcCHS2基因表達分析

我們利用RT-PCR的方法，用AcTublin作為內標，對不同皮色和不同育性洋蔥的AcCHS1和AcCHS2基因進行了表達分析。結果(圖5)顯示，洋蔥的AcCHS1和AcCHS2基因在不同皮色和不同育性的材料中，其表達沒有顯著差別;但在同等條件下，AcCHS2基因的表達明顯高于AcCHS1。這與在洋蔥基因庫中AcCHS1基因對應1條EST、AcCHS2基因對應8條EST結果相一致。

3 討論與結論

核酸序列和蛋白質序列的分析結果表明，我們已成功克隆了洋蔥AcCHS1和AcCHS2基因的全長cDNA序列。AcCHS1的ORF序列 1 182 bp，預測的蛋白質由393個氨基酸殘基組成;AcCHS2的ORF序列 1 176 bp，預測其編碼的蛋白質由391個氨基酸殘基組成。

查爾酮合成酶是類黃酮類物質生物合成途徑中的關鍵酶，調控著色素合成、防御反應、植物育性等生理生化過程。目前已從苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物中克隆了約700個CHS基因及其相關基因的序列，從基因結構看， 多數CHS基因包含1個內含子和2個外顯子，并且內含子的位置在所有已知序列中相同[8，9]。我們可以借鑒這些成果，設計合適的引物從洋蔥基因組DNA中擴增AcCHS1和AcCHS2基因的內含子，并進一步進行多態性分析。

研究發現在多數植物基因組中存在CHS重復基因。我們已經克隆了2個洋蔥CHS基因，是否還存在其它成員，還有待進一步的研究。這些重復基因的序列相似性往往很高，但它們的表達模式卻明顯不同[9，10]。我們也得到了類似的結果:相同條件下，AcCHS2基因的表達明顯高于AcCHS1。重復基因表達模式的分化在很大程度上受啟動子和順式調節元件的影響。下一步，我們可以用繆軍等[11]的方法，克隆AcCHS1和AcCHS2基因的啟動子，對它們的表達和調控做深入地分析。

對紫花苜蓿(Medicago sativa)的一個查爾酮合成酶蛋白的晶體結構進行研究，證實其活性位點為Cys164、Phe215、His303和Asn336， 這4個氨基酸殘基在至今發現的所有查爾酮合成酶中均相同[12]。本研究結果也證明了這一點。這種高度一致的基因結構說明:所有查爾酮合成酶基因可能來源于一個共同的祖先基因。

查爾酮合成酶活性的積累與類黃酮類物質的積累是緊密相關的，因此對查爾酮合成酶的分子生物學研究可以為提高農作物中類黃酮類物質的合成，產生對人類健康有益的食品奠定基礎。

參 考 文 獻:

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