楊樹葉片離體再生系統(tǒng)的構(gòu)建

摘 要:以楊樹葉片為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，使用不同激素不同濃度配比，建立了楊樹葉片離體培養(yǎng)植株再生體系。結(jié)果表明:葉片的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L;不定芽培養(yǎng)基為:MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。NAA與BA對愈傷組織誘導(dǎo)有調(diào)控作用，NAA/BA比值增大有利于不定芽的誘導(dǎo)，但不能超過4∶1;BA與2，4-D關(guān)系比較復(fù)雜，當(dāng)2，4-D和6-BA的濃度均為1.0 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)效果最好。

關(guān)鍵詞:歐美108楊葉片;組織培養(yǎng);植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號:S792.110.5 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2010)05-0008-03

楊樹是世界上廣泛栽培的重要造林樹種，因其速生豐產(chǎn)、無性繁殖能力強(qiáng)、基因組較少而成為林木遺傳改良的理想模式植物[1]。自1964 年Mathes獲得楊樹試管苗以來，國內(nèi)外許多學(xué)者采用楊樹莖尖、葉片、莖段和腋芽做外植體，均獲得成功，但以葉片培養(yǎng)增殖倍率高[2]。筆者采用歐美108楊的嫩葉為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，使用不同激素不同濃度配比，建立了楊樹葉片離體培養(yǎng)植株再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以歐美108楊一年生枝條為材料，扦插土培一個月后，取剛剛生長出的幼嫩葉片作為外植體。

1.2 外植體的滅菌、接種、培養(yǎng)

以葉片為外植體，自來水沖洗30 min，10%酒精消毒10 s，無菌水沖洗2次，每次1 min，0.1% HgCl2浸泡4 min，無菌水漂洗4遍，每次2 min。葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小方塊，葉背向下平放于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度25℃，光照14 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx。

1.3 培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加不同激素組合、30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，配制成M1～M6共6種培養(yǎng)基(表1)。在滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值到5.8 ，并且在0.1 MPa (121℃) 的條件下保持20 min ，以達(dá)到滅菌的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹葉片愈傷組織的誘導(dǎo)將經(jīng)處理的外植體均勻接種于M1、M2、M3、M4、M5、M6 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。表2 表明，在M1、M2、M3、M4、M5 培養(yǎng)基上幾天后大部分外植體開始膨大，2～3 周后長出綠色或紅色的愈傷組織。其中，M2、M3培養(yǎng)基上出現(xiàn)大量愈傷組織，基本為綠色，少量為紅色，致密，數(shù)量明顯多于M1 培養(yǎng)基;M4、M5 培養(yǎng)基上出現(xiàn)較多的不定芽，愈傷組織很少，且M4 誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽明顯多于M5;但M6 培養(yǎng)基上的外植體只表現(xiàn)為輕微膨大，兩周后褐化死亡。

NAA與BA對愈傷組織的誘導(dǎo)有調(diào)控作用，NAA/BA比值增大有利于不定芽的誘導(dǎo)，但當(dāng)NAA與BA比值為4∶1時，無愈傷組織出現(xiàn)，也不誘導(dǎo)不定芽，這表明生長素含量過高的培養(yǎng)基不適合誘導(dǎo)愈傷組織。BA與2，4-D關(guān)系比較復(fù)雜，當(dāng)2，4-D和6-BA的濃度均為1.0 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)效果最好。另外，帶葉柄的葉片出現(xiàn)愈傷組織所需的時間短，并且通常在葉柄處先出現(xiàn)白色膨大，逐漸長出綠色的愈傷組織

2.2 楊樹葉片不定芽的誘導(dǎo)將在M3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)得到的愈傷組織接種于M4培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，4周后，愈傷組織誘導(dǎo)出大量不定芽。

2.3 楊樹不定芽的繼代和生根培養(yǎng)將在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上獲得的叢生芽單個接種在繼代培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.1 mg/L+ NAA 0.02 mg/L+GA3 0.2 mg/L)上繼代增殖培養(yǎng)，3～4周后選長勢良好的不定芽接種于生根培養(yǎng)基(MS+IBA 0.5 mg/L)，4周后得到生根的完整小植株。

3 討論

歐美108 楊扦插繁殖簡便易行，但受制于季節(jié)因素，利用組織快繁能打破這種限制。其它楊樹品種的組培快繁已有一些研究報道[3，4]，孫宇飛等(2004)[5]成功建立了歐美107 楊組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)，但歐美108 楊組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)研究未見報道。較其它品種楊樹而言，該品種具有顯著的速生性能和優(yōu)良的品質(zhì)，進(jìn)行耐鹽轉(zhuǎn)基因研究有廣泛的應(yīng)用開發(fā)前景。因此，該系統(tǒng)的建立具有重要的理論和實踐意義。

試驗中，幼嫩葉片和葉柄切口處雖然有少量褐色物質(zhì)滲出，但幼嫩外植體的細(xì)胞分裂能力很強(qiáng)，在切口處依然有愈傷組織形成，基本上不會影響愈傷組織的誘導(dǎo)率。若以較老的葉片、葉柄做外植體，則切口處褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，隨著培養(yǎng)時間的延長，褐變面積會從切口處擴(kuò)展到整個外植體，進(jìn)而影響愈傷組織的誘導(dǎo)率。造成這種后果的原因可能有:①外植體的成熟程度影響誘導(dǎo)率。通常情況下，褐變隨材料的年齡和組織木質(zhì)化程度的增加而增加。②取材時期不合適。很多關(guān)于組織培養(yǎng)的報道都提出取材時期會影響外植體的褐變[6～9]。李昆(2007)[6]研究發(fā)現(xiàn)，在3～4月間取剛萌發(fā)的葉片、葉柄甚至莖段作外植體，消毒工作很容易進(jìn)行，所用消毒時間較短，向外滲出的褐色物質(zhì)很少，而且外植體分化能力很強(qiáng)，基本上在外植體邊緣發(fā)生的小部分褐變不會影響到誘導(dǎo)率。另外，在超凈工作臺上切割外植體時，手術(shù)刀要鋒利，切割要迅速準(zhǔn)確，切口保持平整，避免傷害過大。同時，外植體切下后，要迅速接入培養(yǎng)基，避免其切口與空氣長時間的接觸。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] 林善枝，肖基滸，張志毅.楊樹分子標(biāo)記研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2000，22(6):79-83.

[2] 馬同富，馬宗新.楊樹葉片高效離體再生系統(tǒng)的構(gòu)建[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23(12):88-92.

[3] 王學(xué)聘，韓一凡，戴蓮韻，等.抗蟲轉(zhuǎn)基因歐美楊的培育[J].林業(yè)科學(xué)，1997，33(1):69-74.

[4] 杜寧霞，李 云，于海武，等.毛白楊葉片再生系統(tǒng)的建立(英文)[J].中國林學(xué)(英文版)，2002，2(4):48-51.

[5] 孫宇飛，高秀華，趙彥修，等.歐美107楊組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立[J].山東師范大學(xué)學(xué)報，2004，19(2):85-87.

[6] 李 昆.I-63楊和I-69楊組織培養(yǎng)研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2007.

[7] 王玉珍，劉香玲，羅景蘭.大葉飼料型刺槐組培技術(shù)體系的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，4:9-11.

[8] 蔡小寧，楊 陽，楊 平，等.鹽芥葉片組織培養(yǎng)再生植株的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(1):42-43.

[9] 于志水，金 紅，王麗鈞，等.黑楊派楊樹組培再生系統(tǒng)的研究[J].遼寧林業(yè)科學(xué)，2002，6:11-13.