鹽酸克倫特羅酶標抗原的制備及其ELISA檢測

陳 曦， 曹 慧， 徐 斐， 李紅梅， 于勁松

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093)

鹽酸克倫特羅(CL)俗稱瘦肉精，為一種β興奮劑、平喘類藥物。然而一些不法分子為提高豬肉中瘦肉含量，將其添加在飼料中，而殘留在禽畜體內的鹽酸克倫特羅代謝消除緩慢，會通過食物鏈直接危害到人類健康。美國食品和藥物管理局(FDA)和世界衛生組織(WHO)制定了畜產品中瘦肉精的最高殘留限量，其中，畜肉中的最高殘留限量為0.2 μg/kg［1］。目前用于瘦肉精檢測的試劑盒大多采用間接競爭ELISA技術，但這種方法步驟繁瑣，操作復雜。而直接競爭性ELISA法根據受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合的原理進行檢測，可提高檢測效率，節省檢測成本。

直接競爭ELISA法中所用酶標抗原的標記酶主要有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酯酶(AP)。堿性磷酸酯酶成本較高，辣根過氧化物酶是ELISA中應用最為廣泛的標記酶。辣根過氧化物酶具有較易提取、價格相對低廉、性質穩定及與抗原或抗體偶聯后活性損失小等優點。目前，酶標記抗原的制備方法主要有偶氮化法［2-3］、戊二醛法［4］、碳二亞胺(EDC)法［5］等。其中偶氮化的反應過程過于激烈，酶活性損失很大，不能用于酶標抗原的合成。本試驗選取辣根過氧化物酶作為抗原標記酶，采用EDC法制備酶標抗原，并對酶標抗原的性質進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

碳二亞胺(EDC)、琥珀酸亞胺(NHS)，均為上海延長生物有限公司產品;戊二醛、酪氨酸為國藥化學試劑有限公司產品;辣根過氧化物酶(HRP)，為上海東風生物科技有限公司產品;Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、Na2CO3、NaHCO3、檸檬酸鈉、亞硝酸鈉等，均為分析純，為上海高信化工有限公司產品;試驗用水為雙蒸去離子水。

1.2 酶標抗原的制備

采用EDC法［6-9］制備酶標抗原，步驟為:① 鹽酸克倫特羅的重氮化:稱取25 mg鹽酸克倫特羅溶于4 ml預冷的1 mol/L鹽酸中;逐滴加入0.27 mol/L NaNO2溶液，采用淀粉碘化鉀試紙進行檢測，待其為深紫色時停止滴加NaNO2溶液;4℃冰浴避光反應45 min。②鹽酸克倫特羅的衍生化:稱取15 mg酪氨酸溶于0.5 ml 1 mol/L氫氧化鈉溶液中，用pH 9.6的碳酸鹽緩沖稀釋至2 ml;將步驟①中重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢逐滴加入到酪氨酸溶液中，不斷攪拌，同時用1 mol/LNaOH溶液調整pH值使其保持在9.0至9.6之間;將反應液置于4℃冰箱中緩慢攪拌12 h，之后用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到鹽酸克倫特羅的重氮化衍生物。③酶標抗原的偶聯:取2 ml鹽酸克倫特羅重氮化衍生物溶液，依次加入14.3 mg碳二亞胺和2.4 mg琥珀酸亞胺，室溫攪拌反應2 h;再加入10 mg辣根過氧化物酶，將混合反應液放入4℃冰箱內緩慢攪拌12 h;4℃透析除去游離的碳二亞胺、琥珀酸亞胺、鹽酸克倫特羅及鹽酸克倫特羅重氮化衍生物等小分子;封閉游離的活性基團后，采用直接ELISA法對偶聯液進行鑒定。

1.3 直接競爭ELISA法鑒定酶標抗原與抗鹽酸克倫特羅抗體的親和力

參照文獻［10］的方法，將抗鹽酸克倫特羅抗體用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后，加入到96微孔板中，每孔100 μl，4 ℃孵育12 h;倒出微孔板內液體，每孔加入 250 μl清洗液清洗5次;于微孔板內加入3%明膠溶液，每孔150 μl，37℃孵育2 h;將所制備的酶標抗原稀釋20倍，分別加入到微孔板中，每孔100 μl，37℃孵育1 h，每個稀釋度做5個平行;重復上述洗滌步驟后，向微孔板內加入 3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺 (TMB)底物，每孔100 μl，室溫反應20 min。加入1 mol/L硫酸終止反應，并于450 nm下用酶標儀讀數。

1.4 酶標抗原制備條件的優化

根據單因素試驗結果，確定影響酶標抗原制備的主要因素，并以酶標抗原的酶活性大小為評價指標，設計3因素3水平正交試驗，以確定最佳的酶標抗原制備工藝。

1.5 直接競爭ELISA法抑制標準曲線的繪制

按照方法1.3中的方法進行操作。以鹽酸克倫特羅濃度的對數值作為橫坐標，抑制率作為縱坐標，制作直接競爭ELISA抑制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鈉用量對酶標抗原酶活性的影響

在酸性條件下，亞硝酸鈉可將鹽酸克倫特羅的伯氨基重氮化。由酶標抗原活性隨亞硝酸鈉用量變化的曲線可以看出，隨亞硝酸鈉溶液體積的增加，酶標抗原與抗鹽酸克倫特羅抗體的親和力呈上升趨勢，并在亞硝酸鈉溶液體積為0.8 ml(濃度為0.27 mol/L)時，重氮化反應的效果最好，之后隨著亞硝酸鈉用量的進一步增加，其親和力下降。

2.2 鹽酸克倫特羅與酪氨酸(Tyr)摩爾比對酶標抗原酶活力的影響

碳二亞胺偶聯法通常適用于有羧基的半抗原分子的偶聯，對于只含有氨基的半抗原，則需要先與含有羧基的蛋白質載體形成中間產物，再與碳二亞胺偶聯。由酶標抗原活力隨鹽酸克倫特羅與酪氨酸摩爾比變化的曲線可以看出，在鹽酸克倫特羅與酪氨酸的摩爾比為1∶3時，鹽酸克倫特羅衍生化的效果最好。

2.3 鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺摩爾比對酶標抗原酶活力的影響

酶標抗原活力隨鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺摩爾比變化的曲線顯示，隨著鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺摩爾比的增加，OD值顯著增加，即酶標抗原的酶活性顯著增加，并在兩者比例為1∶4時達最大值。當鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺的摩爾比超過1∶4時，酶活性沒有顯著性變化，因此選用兩者摩爾比例為1∶4進行偶聯。

2.4 反應時間對酶標抗原酶活性的影響

由酶標抗原活力隨著反應時間變化的曲線可以看出，隨著反應時間的增加，酶活性顯著增高，這表明碳二亞胺與鹽酸克倫特羅衍生物的偶聯效果也越好。當反應時間超過2 h后，酶活性達到最大值，即偶聯效果最好。因此選用2 h進行碳二亞胺與鹽酸克倫特羅的偶聯反應。

2.5 酶標抗原制備條件的優化

根據單因素試驗的結果，固定鹽酸克倫特羅與酪氨酸的摩爾比為1∶3，辣根過氧化物酶與碳二亞胺的摩爾比為1∶400，選取亞硝酸鈉用量、鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺摩爾比和反應時間進行正交試驗設計。制備酶標抗原的較優工藝條件為，亞硝酸鈉用量為0.8 ml，鹽酸克倫特羅衍生物與碳二亞胺摩爾比為1∶4，反應時間為2.5 h，此條件下制備出的酶標抗原酶活性為1.487 U/mg。鹽酸克倫特羅衍生物與碳二亞胺的摩爾比對酶標抗原酶活性的影響在0.05水平上最顯著。

2.6 直接競爭ELISA抑制標準曲線

繪制鹽酸克倫特羅直接競爭ELISA標準抑制曲線，可以看出在1 ng/ml至10 ng/ml之間，抑制率與濃度呈現較好的線性關系。最低檢測限為1 ng/ml。

3 結論

采用碳二亞胺偶聯鹽酸克倫特羅半抗原與辣根過氧化物酶法制備酶標抗原，通過單因素和正交試驗確定了最佳制備工藝條件:亞硝酸鈉用量為0.8 ml(濃度為0.27 mol/L)，鹽酸克倫特羅與酪氨酸的摩爾比為1∶3，鹽酸克倫特羅衍生物與碳二亞胺的摩爾比為1∶4，反應時間為2.5 h，辣根過氧化物酶與碳二亞胺的摩爾比為1∶400，此條件下制備出的酶標抗原酶活性為1.487 U/mg。采用此酶標抗原進行直接競爭ELISA測定，繪制出的競爭性抑制標準曲線線性關系較好，最低檢測限為1 ng/ml。

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