二苯乙烯苷對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白及分揀蛋白相關(guān)受體1 mRNA表達(dá)的影響

楊曉穎　劉　寧　黃岑漢　劉燕平　黃炳臣　黃永秩　黃忠仕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西　南寧　530000)

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二苯乙烯苷對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白及分揀蛋白相關(guān)受體1 mRNA表達(dá)的影響

楊曉穎劉寧1黃岑漢1劉燕平黃炳臣1黃永秩1黃忠仕1

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530000)

〔摘要〕目的研究二苯乙烯苷(TSG)對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白(APP)及分揀蛋白相關(guān)受體(SORL)1表達(dá)的影響。方法3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠50只，隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥石杉?jí)A甲組、TSG高、中及低(0.3，0.1，0.033 g/kg ) 劑量組，另取同齡C5B7L/6J鼠10只為正常對(duì)照組。各組給予相應(yīng)藥物60 d后，采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察小鼠海馬神經(jīng)元的一般結(jié)構(gòu)；免疫組化SABC法檢測(cè)各組小鼠腦組織APP蛋白的表達(dá)。FQ-PCR法檢測(cè)SORL1 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果與模型組比較，各組小鼠大腦皮層及海馬區(qū)形態(tài)均有不同程度恢復(fù);APP表達(dá)量均下降(P<0.01，P<0.05);SORL1 mRNA表達(dá)均有所上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論TSG治療阿爾茨海默病(AD)的機(jī)制可能與促進(jìn)SORL1 mRNA生成、抑制APP異常代謝、減少老年斑的生成等機(jī)制有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕二苯乙烯苷；阿爾茨海默病；β淀粉樣前體蛋白；分揀蛋白相關(guān)受體1

1右江民族醫(yī)學(xué)院

第一作者：楊曉穎(1990-)，女，在讀碩士，主要從事中醫(yī)診治與辨證的客觀化規(guī)范化研究。

雖然阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但越來(lái)越多的研究證明，β淀粉樣蛋白(Aβ)的聚集在AD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起了關(guān)鍵作用〔1〕。2007年Rogaeva等〔2〕首次提出Sortilin相關(guān)受體基因分揀蛋白相關(guān)受體(SORL)1可能是AD患病的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子，其機(jī)制與SORL1調(diào)控Aβ的相關(guān)代謝途徑、參與淀粉樣前體蛋白(APP)裂解環(huán)節(jié)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬探討二苯乙烯苷(TSG)治療AD的作用及APP和SORL1在致病過(guò)程中可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和同遺傳背景C5B7L/6J小鼠。雄性，體重26~30 g，SPF級(jí)，均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供〔動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004〕。

1.2主要試劑TSG(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào) 14112)，石杉?jí)A甲(河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H10940156)。一抗：APP兔抗鼠多克隆抗體(abcam公司，編號(hào)：ab15272)，二抗：二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒;DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。總RNA提取試劑盒(TaKaRa,Code No.9767)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,Code No.RR047A),實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(TaKaRa,Code No.RR820A),均購(gòu)自大連寶生物有限公司。

1.3主要儀器HMIAS-2000W高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析管理系統(tǒng)(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科提供，型號(hào)：LOGENE-I)。超微量分光光度計(jì)(德國(guó)IMPLEN公司，型號(hào)：Nanophtoometer Pearl360)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(培清科技，型號(hào)：JS-680B)，電泳儀(北京六一儀器廠，型號(hào)：DYY-6D)普通梯度PCR儀(美國(guó)BIO-RAO公司，型號(hào)：PTC-200)，Real Time PCR儀(美國(guó)BIO-RAO公司，型號(hào)：IQ5)。

1.4動(dòng)物分組與給藥3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠50只，隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥石杉?jí)A甲組及TSG高、中、低劑量組，每組10只。另外，選擇3月齡C5B7L/6J雄性小鼠10只作為正常對(duì)照組。模型組、正常對(duì)照組：生理鹽水，30 ml/kg；石杉?jí)A甲組0.15 mg/kg；TSG高、中、低劑量組：TSG各組劑量依次為0.3，0.1，0.033 g/kg。以上各組每日灌胃給藥1次，連續(xù)60 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)標(biāo)本制備：治療結(jié)束后，冰上迅速取出小鼠腦組織，放入10%甲醛固定1 w。石蠟包埋、切片，60℃烤箱內(nèi)烘烤2 h后，常溫保存以備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.1蘇木素-伊紅(HE)染色脫蠟、梯度酒精脫水各5 min、蘇木素染色5 min，水洗。1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗返藍(lán)。伊紅染色1 min后，水洗。梯度酒精脫水透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察。

1.5.2免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液沸水煮2 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，2次/min，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS沖洗3×2次/min，山羊血清封閉室溫孵育15 min(勿洗，甩干即可)。滴加APP兔抗鼠多克隆抗體(均按1∶100稀釋)，4℃ 孵育過(guò)夜，PBS沖洗3×2次/min。聚合物輔助劑室溫孵育20 min，辣根酶標(biāo)記物山羊抗兔/小鼠IgG多聚體室溫25 min。DAB顯色、蘇木素輕度復(fù)染、常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，樹(shù)膠封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定方法：各組隨機(jī)選取小鼠腦組織切片4張，每張切片在大腦皮層和海馬區(qū)各取5個(gè)視野(400倍)，觀察計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)染為棕色的APP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。總和除以5作為該小鼠的陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

1.5.3FQ-PCR取含海馬區(qū)的小鼠腦組織，液氮研磨后提取總RNA，紫外分光光度計(jì)分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA濃度、純度、完整性。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)合成。PCR反應(yīng)條件：①SORL1：上游引物 5′-GATGCGGATTGCCAGGATG-3'，下游引物5'-ATGCTTGCTGGACGGGATG-3',②GAPDH:上游引物5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物5'-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3'。 SYBR@ R Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA模板2 μl，加dH2O至總反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件：(二步法擴(kuò)增條件)：SORL1、GAPDH的擴(kuò)增，第一步：預(yù)變性，95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步:95℃，5 s，61℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)；55℃，30 s，共81個(gè)循環(huán)。通過(guò)2-△△CT法表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件，多組計(jì)量資料采用ANOVA檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)觀察正常組小鼠大腦皮層和海馬形態(tài)完整，神經(jīng)元數(shù)量多、結(jié)構(gòu)致密、分布均勻，鮮見(jiàn)細(xì)胞空泡變性及壞死。模型組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少，同時(shí)可見(jiàn)多處細(xì)胞體積縮小，胞核固縮，染色加深，并伴有大量的小膠質(zhì)細(xì)胞增生。與模型組相比，各治療組腦皮層及海馬區(qū)形態(tài)均有不同程度恢復(fù)。

2.2APP免疫組化結(jié)果陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)充滿棕黃色顆粒，部分鄰近胞膜處染色較深。陽(yáng)性細(xì)胞在正常對(duì)照組也有弱表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，模型組大腦皮層及海馬區(qū)APP蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01),與TSG高、中、低劑量組和石杉?jí)A甲組相比表達(dá)量無(wú)明顯變化(P>0.05)。與模型組相比，石杉?jí)A甲組和TSG高、中、低各劑量組大腦皮層和海馬區(qū)APP陽(yáng)性表達(dá)量均明顯減少(P<0.05或P<0.01)，其中TSG高劑量組下降最為明顯；與石杉?jí)A甲組相比，TSG各劑量組表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1，圖1，圖2。

表1　TSG對(duì)各組小鼠大腦皮層及

與模型組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

圖1　海馬區(qū)APP表達(dá)免疫組化結(jié)果(×400)

圖2　大腦皮層APP表達(dá)免疫組化結(jié)果(×400)

2.3SORL1 FQ-PCR結(jié)果與正常對(duì)照組(1.288±0.681)相比，模型組SORL1 mRNA表達(dá)量(0.854±1.45)明顯減少(P<0.01),與TSG高、中、低劑量組(分別為1.03±0.108、1.023±0.603、1.021±0.173)和石杉?jí)A甲組(1.043±0.986)相比表達(dá)量無(wú)明顯變化(P>0.05)；與模型組相比，TSG高、中、低劑量組和石杉?jí)A甲組，SORL1 mRNA表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05)；與石杉?jí)A甲組相比，TSG各劑量組mRNA表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

SORL1基因位于第11號(hào)染色體上，是一種脂蛋白受體同源體，主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大腦皮質(zhì)的椎體細(xì)胞、小腦浦肯野細(xì)胞和海馬區(qū)亦有高表達(dá)〔3〕。SORL1作為APP的一種選擇性蛋白受體，能輔助APP在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。SORL1與APP結(jié)合后，能明顯降低APP被β-水解酶水解成Aβ的可能性〔4〕。Aβ是AD主要病理改變老年斑的核心成分和中心環(huán)節(jié)〔5，6〕。APP作為Aβ的前體蛋白，合成后約有10%會(huì)成為跨膜蛋白，其余的大部分在細(xì)胞內(nèi)被分泌酶水解〔7〕。正常情況下，APP的主要代謝途徑為α途徑。在APP發(fā)生基因突變、缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥等病理情況下，APP由α代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)棣隆ⅵ么x途徑，α分泌酶表達(dá)減弱，β分泌酶和γ分泌酶表面活性增強(qiáng)，是導(dǎo)致Aβ沉積的主要原因〔8，9〕。Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，在AD病人腦組織中，由于Aβ大量沉積，引發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激和神經(jīng)元丟失，并引起tua蛋白異常磷酸化、軸突損傷和突觸丟失從而導(dǎo)致病人失去認(rèn)知能力〔10〕，降低Aβ在大腦內(nèi)的蓄積量可延緩或減輕AD的癥狀〔11〕。研究表明SORLl可使APP重新分配，減少APP在γ分泌酶水平上的分解，從而減少Aβ的生成。

TSG是中藥何首烏的主要水溶性成分，有較好的抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、降血脂及抗動(dòng)脈硬化等作用〔12，13〕。TSG的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能通過(guò)鈣通道拮抗作用、抗氧化作用、膽堿酯酶抑制劑作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和延緩衰老等途徑而對(duì)腦神經(jīng)起到保護(hù)作用〔14〕。TSG能清除和抑制老年斑的生成，保護(hù)腦組織海馬神經(jīng)元的完整性和促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突的生長(zhǎng)〔15〕。臨床運(yùn)用中發(fā)現(xiàn)何首烏可明顯改善AD患者的記憶能力，其作用機(jī)制可能是多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)的。

海馬是獲取和鞏固信息有關(guān)回路的一個(gè)重要組成部分，特別是近事記憶，因此海馬參與儲(chǔ)存記憶的神經(jīng)過(guò)程〔16〕。同時(shí)，海馬也是AD最先病變的腦區(qū)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)治療后TSG各劑量組和石杉?jí)A甲組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞均有不同程度恢復(fù)，APP蛋白陽(yáng)性表達(dá)量均有所下降，SORL1基因表達(dá)均有所上調(diào)，兩者都以TSG高劑量組治療效果最為明顯，說(shuō)明TSG高劑量組可能是治療AD的有效劑量，達(dá)到了較理想的血藥濃度。根據(jù)以上結(jié)果推斷TSG能夠起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減緩細(xì)胞凋亡進(jìn)程，減少老年斑的沉積作用。其機(jī)制可能與促進(jìn)SORL1的生成，抑制APP的異常代謝途徑有關(guān)，并有可能是在提高SORL1生成基礎(chǔ)之上繼而對(duì)APP的異常代謝途徑產(chǎn)生影響，但也可能為共同作用于兩者產(chǎn)生協(xié)同作用有關(guān)。

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〔2015-12-02修回〕

(編輯李相軍)

Effect of TSG on protein expression of APP in APP/PS1 double transgenic AD mice brain tissues

YANG Xiao-Ying,LIU Ning,HUANG Cen-Han,etal.

Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning 530000,Guangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of TSG on gene expression of β-amyloid precursor protein(APP)and sortilin-related receptor 1(SORL1)in APP/PS1 double transgenic mice brain tissues.MethodsFifty three-months-old APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into model,huperzine A,high-,mid- and low-dose groups of TSG(0.3,0.1,0.033 g/kg),with 10 mice in each group,and another 10 same age C5B7L/6J mice as normal control group.After medication corresponding drugs for 60 days,HE staining was used to observe the general structure of hippocampal neurons,the expression of APP in brain tissue was assayed by immunohistochemical SABC method,and FQ-PCR method was used to detect the expression of SORL1 mRNA.ResultsCompared with those of model group,the cerebral cortex and hippocampus in each group were recovered in different degree,the protein expression of APP was down-regulated(P<0.01,P<0.05),the expression of SORL1 mRNA was up-regulated(P<0.05).ConclusionsTSG has a certain preventive and therapeutic effect on AD that might be related to promoting the generation of SORL1 mRNA,inhibition of the protein expression of APP and reducing the formation of senile plaques.

【Key words】2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside(TSG);Alzheimer's disease;β-amyloid precursor protein(APP);Sortilin-related receptor 1(SORL1)

通訊作者：黃忠仕(1970-)，男，博士，教授，主要從事抗癡呆藥物研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260495)；廣西自然科學(xué)基金資金項(xiàng)目(2013GXNSFAA019212)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R749.1+6

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0536-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.009