4種食源性致病菌的PCR-SSCP檢測技術研究

王 永 趙 新 蘭青闊 朱 珠 程 奕

摘要:采用細菌的16S rDNA保守區引物作為通用引物,對常見食源性致瀉大腸埃希氏菌(Diarrheogenic Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonellae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)進行PCR擴增,產物及其Xmn I酶切后產物進行單鏈構象多態性分析。試驗結果顯示,4種食源性致病菌的PCR產物經Xmn I酶切后進行單鏈構象多態性分析可以相互區別。因此,PCR-SSCP技術可以方便地用于檢測食源性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌。

關鍵詞:食源性致病菌;聚合酶鏈式反應;單鏈構象多態性;檢測

中圖分類號: Q503 文獻標識碼: A 文章編號:1006-6500(2009)01-0001-0013-03

Study on Detection of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria by PCR-SSCP

WANG Yong,ZHAO Xin,LAN Qing-kuo,ZHU Zhu,CHENG Yi

(Central Lab,Tianjin Academy of Agricultural Sciences,Tianjin 300384,China)

Abstract:In order to establish a detection method for identification of four kinds of food-borne pathogenic bacteria including Diarrheogenic Escherichia coli, Salmonellae, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus by using polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), the bacterial 16S rDNA primers conservative region as a universal primers, PCR product and Xmn I digested products of E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and bacillus cereus were analyzed by single strand conformation polymorphism. The results showed that four kinds of food-borne pathogens could be distinguished between each other, after digesting the PCR products by Xmn I. So, PCR-SSCP technique can be used to facilitate the detection of food-borne E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus.

Key words: food-borne pathogenic bacteria;PCR;SSCP;detection

食品安全是直接關系到消費者生命、健康和社會穩定的熱點問題。食品法典委員會(CAC)將微生物性健康危害列為食源性危害的三大原因之一,我國近年微生物性食物中毒比例高達67%[1]。因此,食源性致病菌的檢測與鑒定已成為食品行業不可或缺的關鍵環節。傳統的細菌學檢驗與鑒定需要進行增菌、分離培養以及生化反應等繁瑣步驟,既費時又費力,但對于有些細菌仍無法給出正確的鑒定[2]。隨著分子生物學技術的發展,PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(FISH)、基因芯片(Microarry)、流式細胞技術(FCM)等技術被廣泛用于微生物種群鑒定及臨床診斷,上述問題迎刃而解。

聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)技術是建立在PCR基礎上的單鏈構象多態性分析技術。SSCP技術在原理上甚至可以檢測出基因片段中單個堿基的差異[3-4]。16S rDNA是細菌相對保守的基因,經常用于細菌分類。本試驗旨在探討以16S rDNA保守區段為PCR擴增對象,運用SSCP技術對致瀉大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽胞桿菌進行分析,以期為食源性致病菌的快速鑒定提供方法依據。

1材料和方法

1.1 材 料

1.1.1菌株的選擇與培養標準菌株選取致瀉大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌,以上菌株均為ATCC標準菌株,本室保存。菌株復蘇后接種于相應的增菌培養基中過夜培養。

1.1.2 主要試劑和儀器PCR引物由上海生工公司合成,Taq酶、dNTP、PCR產物純化試劑盒等購自Promega公司,Chelex-100購自Sigma公司,限制性內切酶Xmn I購自BBI公司,高速冷凍離心機為Backman公司產品,凝膠電泳設備為BIO-RAD Power 200及Power 1000,PCR擴增儀為Thermo PX2,凝膠成像設備為北京六一公司產品。

1.2 方 法

1.2.1 標準菌株DNA的提取 菌株接種于增菌培養基過夜培養,取培養液100 μL,5 000 r/min離心3 min,棄上清,沉淀用無菌水洗兩次,加入100 μL10% Chelex-100,沸水浴5 min,12 000 r/min離心取上清液作為PCR反應的DNA模板[5]。

1.2.2 16S rDNA引物的選擇 選擇在16S rDNA的保守序列區間(1 170~1 189,1 522~1 540)作為本研究通用引物,引物序列:上游引物 5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3';下游引物 5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3',擴增產物大小為370 bp[6]。

1.2.3 PCR擴增及PCR反應體系組成 10×PCR反應緩沖液(含Mg2+ )2.5 μL,dNTP溶液(各為10 mmol/μL)0.5 μL,正反引物(10 pmol/μL)各0.5 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,模板5 μL,水補足反應體系,使總體積為25 μL。循環參數為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s,55 ℃復性40 s,72 ℃延伸40 s,30個循環,最后72 ℃延伸5 min。擴增產物于加入EB的2.0% 瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下觀察,用DL 2 000做分子量標記。

1.2.4 擴增產物的純化PCR擴增產物的純化及酶切 PCR擴增產物的純化按說明書進行,使用OLIGO 6.0軟件分析擴增產物酶切位點情況,選取Xmn I作為本研究使用的限制性內切酶。酶切反應體系:10×酶切緩沖液2 μL,Xmn I 0.5 μL,PCR擴增產物10 μL,補ddH2O至20 μL,37 ℃保溫3 h,2%瓊脂糖凝膠電泳觀測結果。

1.2.5 SSCP分析 5 μL擴增產物或酶切產物與5 μL變性液(5 mmol/L EDTA,0.5 g/L溴酚蘭,0.5 g/L二甲基苯青,95%甲酰胺)混勻,沸水浴5 min,迅速置于冰上。取2 μL處理產物上樣于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳條件:電泳槽置于4 ℃,1×TBE,100 V 4 h。電泳結束后進行銀染染色并掃描。

2結 果

2.116S rDNA基因的通用引物PCR擴增結果

利用16S rDNA基因的通用引物擴增4種食源性致病菌,結果均在370 bp處得到清晰條帶,如圖1所示。

2.2PCR產物酶切結果

4種致病菌16S rDNA保守區段的擴增產物經Xmn I酶切后,結果見圖2。從酶切譜圖可以看出,本試驗所研究的4種致病菌譜帶極為相似,具有很高的同源性。

2.3SSCP分析結果

16S rDNA擴增產物直接SSCP分析結果顯示,蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌SSCP圖譜非常相似,如圖3所示。16S rDNA擴增產物經Xmn I酶切后的SSCP圖譜能夠很好地區分大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌及金黃色葡萄球菌,如圖4所示。

3 討 論

食源性致病菌常用的檢測方法就是選擇培養基培養和生化鑒定,鑒定過程需要很長時間,而最終的鑒定結果也不一定準確,往往會錯失病情控制的時機。本研究通過PCR擴增產物及其Xmn I酶切產物的SSCP分析研究得知,PCR擴增產物的直接SSCP分析不能很好地區分大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌,而PCR產物經Xmn I酶切后的SSCP分析能夠清楚地鑒定上述4種常見食源性致病菌。本研究結果顯示,當核酸片段小于250 bp時SSCP分析更利于區分大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌。以上結果說明,PCR產物酶切后的SSCP分析技術可以方便地用于檢測食源性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌。

參考文獻:

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