一株產堿性蛋白酶的酵母菌發酵條件優化

李亞玲 趙玉潔 謝風行 周 可 張峰峰

摘要:對一株產堿性蛋白酶假絲酵母菌(Candida sp.N9211)的發酵條件進行了優化,研究各種碳源、氮源及無機鹽對產酶的影響,應用正交試驗優化發酵培養基組成。結果表明:最佳培養基組成為酵母膏20 g/L,蛋白胨15 g/L,干酪素20 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L。優化后蛋白酶活性提高了27倍(由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL)。搖瓶培養的最佳條件為:初始pH值10.0,接種量1%,發酵溫度35 ℃,最佳培養時間為15 h。

關鍵詞:堿性蛋白酶;酵母菌;產酶條件

中圖分類號: Q93;TQ925文獻標識碼:B 文章編號:1006-6500(2009)01-0005-05

Optimization of Medium and Cultivation Conditions for Alkaline Protease Production by Candida sp.N9211

LI Ya-ling, ZHAO Yu-jie, XIE Feng-xing, ZHOU Ke, ZHANG Feng-feng

(Tianjin Reararch Center of Agriculture Biotechnology, Tianjin 300192, China)

Abstract:The culture of Candida sp.N9211 were optimized for the production of alkaline protease. The optimum medium (per liter) wasconsisted of 20 g yeast extract, 15 g peptone, 20 g casein, 0.01 g FeSO4. After optimization of the culture medium, the enzyme production in shake flasks was enhanced from 1.55 U/mL to 41.85 U/mL. The optimum fermentation conditions were determined as follows: initial pH 10.0, inoculation size 1%, temperature 35 ℃, and cultivation time 15 h.

Key words: alkaline protease; yeast; fermentation conditions

堿性蛋白酶是一類適宜于在堿性條件下(pH9～10左右)水解蛋白質肽鍵的酶類,是非常重要的工業用酶[1]。在我國,利用嗜堿性微生物生產堿性蛋白酶的研究還處于起步階段。目前,蛋白酶主要來源于芽孢桿菌屬[2,3]。生產菌株的單一性不但不能滿足制革、絲綢、日化工業對多種酶類生產的需求[4],而且芽孢桿菌在工業生產過程中產生的芽孢往往影響產品的產量和質量[5]。另外,目前能專一識別特定氨基酸序列的蛋白酶還很少,從微生物中進行廣泛篩選應該是尋找這類蛋白酶的途徑之一[6]。因此,打破現有產酶菌種的局限性,積極開發新菌種勢在必行。劉文斌[5]從黃石土壤中分離到一株毛狀假單胞菌,酶活力為45.0 U/mL。梅承芳等[7]從堿湖中分離出一株產蛋白酶的弧菌,產酶能力為3 268 U/mL。池振明等[8]從海洋中分離出一株酵母菌,經培養條件優化后產蛋白酶能力為7.2 U/mL。王躍軍[9]、李樹軍等[10]也先后發現了產蛋白酶的非芽孢桿菌菌株。這些研究都拓寬了我國產堿性蛋白酶的菌種資源,豐富了蛋白酶的種類。

目前,關于產堿性蛋白酶的酵母菌的報道甚少,本課題組在天津鹽堿沼澤中篩選出一株酵母菌株(Candida sp.N9211),具有較高的產蛋白酶能力。本研究在此基礎上以酵母菌株N9211為出發菌株,通過蛋白酶活性的變化對發酵培養基成分和發酵條件進行優化,使其產蛋白酶的能力提高了27倍,為有關酶的分離純化、酶學性質研究及發酵工程菌構建奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 菌 種

酵母菌株Candida sp.N9211為本研究所篩選保藏菌種。

1.2 試 劑

干酪素、L-酪氨酸、三氯乙酸、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、濃溴水等各種化學式劑均為分析純,購自天津科威試劑公司。

1.3培養基

種子培養基:YPD培養基,成分為2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸膏。

發酵培養基:根據需要,由種子培養基添加一定量的不同碳源或氮源物質及無機鹽組成。

1.4培養方法

將保存的酵母菌種N9211接到種子培養基中,于30 ℃、180 r/min的條件下進行培養。對數生長期中后期的培養物作為種子液,以1%的接種量轉接入100 mL/250 mL的三角瓶發酵培養基中,根據實驗方案改變培養基及培養條件進行發酵條件試驗。

1.5 酶液制備

取酵母培養液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min,所得上清液用甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液(0.05 mol/L,pH9.0)進行適當稀釋后得粗酶液。

1.6 分析方法

1.6.1 酶活的測定[11]在1 mL粗酶液中加入1 mL用甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液(0.05 mol/L,pH 9.0)配制的2%的酪蛋白溶液,40 ℃精確反應10 min后迅速加入2 mL10%的TCA溶液(三氯乙酸)終止反應。4 ℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,加入Folin酚試劑顯色后于650 nm下測OD值。規定用1 mL酶液在40 ℃下水解1 mL質量分數為2%的酪蛋白10 min,以每分鐘釋放1 μg酪氨酸的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.6.2 生物量測定取10 mL發酵液,離心分離菌體,用蒸餾水洗滌3次后收集菌體,80 ℃烘干至恒質量,即為發酵液中的生物量,以g/L計。

2 結果與討論

2.1 不同碳源對產酶的影響

分別以濃度為20 g/L的蔗糖、甘油、乳糖、可溶性淀粉和檸檬酸代替YPD培養基中的葡萄糖,以不加葡萄糖的YPD培養基作對照,滅菌后按1%的接種量將酵母菌種子液接入各培養基中,30 ℃,180 r/min進行過夜培養。培養液離心后Folin酚法測定酶活,考察不同碳源對菌體產酶的影響,結果見圖1。由圖1可知,去掉YPD培養基中的葡萄糖時菌體產酶水平顯著提高,達到11.24 U/mL,比加葡萄糖的YPD培養基的1.55 U/mL提高了7.25倍。蔗糖、檸檬酸等其它糖類和有機酸作為碳源時酶活也比無糖培養基低,這說明糖類和有機酸對酵母菌產蛋白酶具有抑制作用,分析可能是一種分解代謝物阻遏現象。酵母膏和蛋白胨都是復雜的有機物,既可以提供氮源又可以提供碳源,因此,本試驗選用酵母膏和蛋白胨作為酵母菌的碳源物質。

2.2 不同氮源對產酶的影響

氮源對酵母菌產蛋白酶的影響較大,解除了YPD培養基中葡萄糖的抑制作用,剩余的酵母膏和蛋白胨成分為酵母菌提供碳源的同時也提供了豐富的氮源。在酵母膏—蛋白胨培養基中分別添加20 g/L的檸檬酸銨、干酪素、硝酸鉀、硝酸鈉、尿素等各種氮源。結果如圖2所示,添加干酪素的培養基中蛋白酶活性達到12.83 U/mL,比對照的11.67 U/mL提高了10%,干酪素對蛋白酶具有誘導產生的能力。硝酸鉀、硝酸鈉等無機氮源的產酶效果次之。對這幾種氮源做方差分析,并進行多重比較,干酪素與其它幾種氮源相比,有顯著性差異,因此選用干酪素作為添加氮源。

2.3 無機鹽對產酶的影響

堿性蛋白酶需要有金屬離子的激活,必需的金屬離子有Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等[12]。本試驗在含有10 g酵母膏、20 g蛋白胨和10 g干酪素的培養基中分別加入0.01 g/L的硫酸鋅、硫酸亞鐵、三氯化鐵和0.1 g/L的氯化鈣、硫酸鎂、氯化鉀等無機鹽成分,結果如圖3。硫酸鋅和硫酸亞鐵對菌體產酶有促進作用。對這幾種無機鹽做方差分析可知,在培養基中加入硫酸亞鐵對酶活影響較大,與其它幾種無機鹽相比有顯著性差異;硫酸鋅其次,氯化鈣、三氯化鐵和硫酸鎂3種無機鹽沒有顯著性差異,而氯化鉀對菌體產酶表現出抑制作用。添加硫酸亞鐵后蛋白酶活性由14.24 U/mL提高到28.91 U/mL,可見硫酸亞鐵對酵母菌產蛋白酶具有顯著影響。

2.4 培養基正交試驗

根據上述試驗結果,選擇酵母膏、蛋白胨、干酪素和硫酸亞鐵作為發酵培養基組成。為了研究培養基各成分對產酶的影響,設計了一個4因素3水平的正交表進行試驗,正交試驗結果與分析詳見表1和圖4。從表1可知,本試驗所設的4個因素對產酶的影響順序為:酵母膏(A)>蛋白胨(B)>FeSO4(D)>干酪素(C),說明酵母膏是影響產酶的主要因素,其次是蛋白胨、硫酸亞鐵,干酪素影響最小。同時可知,以A因素的水平3,B因素的水平2,C因素的水平3和D因素的水平1的組合酶活性最高,即認為A3B2C3D1為最佳配比。由此得到發酵培養基的最佳配方為:酵母膏20 g/L,蛋白胨15 g/L,干酪素20 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L。

2.5 不同溫度對產酶的影響

由圖5可知,20～30 ℃之間,隨著溫度的升高細胞代謝速度加快,菌體的酶活也隨著提高,30～35 ℃時酶活達到最大值,而后隨著溫度的升高,酶活又迅速降低。

2.6 不同pH值對產酶的影響

pH值是影響細胞生長的一個很重要的因素,不同的嗜堿微生物的嗜堿能力不同,在不同的初始pH值下的生長繁殖能力和產堿性蛋白酶的能力都存在著一定的差異。將發酵液培養基調整至不同的pH值,對產酶的影響結果如圖6所示,菌株N9211產蛋白酶的pH范圍較寬,在pH6～12條件下酶活均在20 U/mL以上,在初始pH值為10時酶活力最高,達40.70 U/mL,這符合堿性蛋白酶菌株對堿性生長環境的需求。

2.7 菌株N9211代謝曲線的測定

菌株N9211代謝曲線的測定將有利于確定最佳發酵時間、pH值、產酶與菌體生長的關系,以及今后的發酵培養等等。在溫度35 ℃、初始pH值10.0、接種量1%、轉速180 r/min條件下,于接種后第3,6,9,12,15,18,21,24,27,30 h取發酵液,測定酶活、生物量和pH值,考察不同發酵時間下菌體生長與產酶的關系。由圖7中pH值的變化可以看出,酵母菌N9211對生長環境中的pH值有一定的調節能力,基本趨勢是體系pH值先降后升,后期穩定保持pH值8～9左右。嗜堿菌一般具有一個比外部環境低的細胞質pH值,盡管外部pH值較高,但細胞內細胞質pH值仍可維持在8.0左右。但關于酵母菌pH調節能力這方面的報道還較少,相關的機理也不是很清楚。可能在菌體生長繁殖期和產酶期對體系pH值具有不同的需要,導致了其自身的pH調節機制。圖7表明,0～20 h酵母菌體大量生長,酶活也逐漸提高,15 h酶活達最大值,20 h以后酵母生長進入穩定期,酶的合成隨著減弱。菌體生長與酶活變化并不完全同步,該酶生物合成類型屬于半藕聯合成型。從產酶過程可見,其培養較合適的時間為15 h。優化培養基和培養條件成效較顯著,優化后的發酵液中酶活比未優化前有了顯著提高,由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL。

3 結 論

以酶活性為考察指標,對酵母菌(Candida sp.N9211)產堿性蛋白酶的培養基和培養條件進行了優化,得到的最佳培養基組成為:酵母膏20 g/L、蛋白胨15 g/L、干酪素20 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L。搖瓶培養的最佳條件為:初始pH值10.0,接種量1%,發酵溫度35 ℃,最佳培養時間為15 h。優化后蛋白酶活性由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL,提高了27倍。本菌株不但拓寬了我國產酶的菌種資源,也豐富了蛋白酶的種類。菌株N9211的產酶能力高于池振明從海洋中分離的布魯氏酵母[8],今后通過基因工程方法對其加以改造將有望進一步提高蛋白酶活力,為功能性酵母菌的開發和在食品、醫藥、飼料、環保等領域的廣泛應用奠定基礎。

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