知母寧抗乙肝病毒作用的實驗研究

丁蔚茅

摘要:目的:觀察知母寧的抗乙肝病毒作用。方法:觀察不同濃度知母寧對體外培養的2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用及對乙肝模型鴨DHBV-DNA的影響。結果:知母寧濃度為4 mg/mL時對2.2.15細胞分泌HBeAg有明顯的抑制作用;以200 mg/kg治療乙肝模型鴨10d后DHBV-DNA水平明顯降低。結論:知母寧有抗乙肝病毒的作用,其機制可能與抑制HBV-DNA的復制有關。

關鍵詞:知母寧;乙肝病毒;2.2.15細胞;DHBV-DNA

乙型肝炎為常見病、多發病,據統計我國已約有一半以上人口經受HBV感染[1]。目前對乙肝的治療多采取綜合療法,其中抗病毒治療是主攻方向,但是到目前為止已發現的抗HBV藥物療效難盡人意。知母寧(Chinonin)是從多種植物中提取出的一種四羥基吡酮的碳糖苷,屬雙苯吡酮類化合物。前期的研究表明Chinonin有抗脂質過氧化作用、抗皰疹病毒作用等[2~3]。有研究認為民間用來治療肝炎的藏茵陳的有效成分為Chinonin[4]。為了進一步深入研究Chinonin的生物活性及藥理特性,我們開展了Chinonin抗乙肝病毒作用的體內外實驗研究,以期篩選出新的高效低毒的抗HBV藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞、動物

2.2.15細胞由廣州空軍醫院提供;1日齡華南麻鴨,由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑

Chinonin(三九藥業生化研究所提供);DMEM(GIBCO);胎牛血清(GIBCO),G418(GIBCO),HEPES;MTT(SIGMA);DMSO(廣州新港化工廠生產);HBeAg,HbsAg檢測試劑盒(華美生物工程公司生產);DHBV質粒(中國醫學科學院醫藥生物技術所生產);缺口翻譯藥盒(promega公司生產);α-32P-dCTP(北京亞輝公司生產);DHBV陽性血清。

1.1.3 實驗儀器

細胞培養瓶、96W培養板、CO2培養箱(NAPCO 5410)、酶標儀(BIO-RAD:3550)、96孔雜交點樣器(美國Bio-rad公司生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 2.2.15細胞培養

2.2.15細胞復蘇后,以DMEM培養基培養于細胞瓶中,長滿后,用0.06%的胰蛋白酶消化2min~3min,棄消化液,加少量DMEM培養液輕輕吹打,制成3×105/mL單個細胞懸液,種于96孔細胞培養板中,每孔0.1mL,37℃,5%CO2,48 h,細胞貼壁后用于實驗。

1.2.2 HBeAg和HBsAg測定

將Chinonin配成多個濃度(從16mg/mL濃度開始倍比稀釋),加于已滴有2.2.15細胞的96孔細胞板中,0.1mL/孔,每濃度4孔;設無藥細胞對照組4孔及空白對照組4孔,每孔加入0.1mL 2%DMEM。加藥培養10d后,吸取培養液于另一96孔板中,即行HBeAg和HBsAg測定,用酶標儀以450nm波長測定OD值(了解抗原的分泌情況)。原96孔板中用MTT染色,每孔加0.4g/L MTT 0.1 mL,37 ℃,5% CO2孵育4 h,棄上清后加DMSO 0.1 mL溶解,然后以490 nm波長比色測定OD值(了解細胞存活情況)。

1.2.3 鴨乙肝模型的建立及給藥

1d齡華南麻鴨,足靜脈注射DHBV陽性血清,每只0.2mL,1w后足靜脈取血,檢測DHBV-DNA陽性者進行實驗。將鴨隨機分3組,模型組、Chinonin高劑量組(200mg/kg灌胃)、Chinonin低劑量組(100mg/kg灌胃)。

1.2.4 DHBV-DNA檢測

分別在給藥前及給藥后5d、10d,停藥后3d,用斑點雜交法檢測DHBV-DNA。(1)探針的標記:DHBV-DNA探針標記采用缺口平移法,按Promego藥盒說明書稍加改動進行。(2)斑點雜交:①點樣:將硝酸纖維素膜用去離子水和10×SSC溶液各浸泡30min,室溫晾干后點膜,40μL/樣,真空抽濾;②變性:將膜分別置于變性液I10min,變性液II 10 min,變性液III 10 min,將變性后的膜室溫晾干,置80℃烤箱中2h,烤干;③預雜交:將膜置3×SSC-0.1%SDS10mL中,65℃,30min,換10×Dendhart-0.1%SDS10mL中,65℃,4h或過夜;④雜交:棄預雜交液,于雜交袋中加入雜交液,封口后42℃,36h~48h;⑤洗膜,用醫用X線膠片,-70℃感光5d后顯影、定影。

1.2.5 計算公式及統計方法數據結果以(x±s)表示,組間均數比較采用t檢驗,以SPSS9.0統計軟件處理,顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 Chinonin對細胞的毒性作用

Chinonin濃度在16mg/mL、8mg/mL時對細胞的毒性較大,破壞率均>50%,而4mg/mL時毒性明顯減弱,破壞率為24.03%,且破壞率隨濃度的下降而下降。經計算,Chinonin的半數毒性濃度(TC50)為6.318。為排除藥物對HBeAg、HBsAg的抑制作用是由于對細胞的毒性所致,故選擇TC50以下的濃度來評價藥效。當Chinonin濃度為4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL時與細胞對照組比較均無顯著差異,提示這4個濃度對細胞沒有明顯的毒性作用。

2.2 Chinonin對抗原的抑制作用

Chinonin在濃度為16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL時對HBeAg均有較好的抑制作用,與細胞對照組比較,P<0.05。經計算,半數有效濃度(IC50)=3.322。而對于HBsAg,Chinonin的抑制作用不明顯,難以觀察到藥物濃度梯度與抑制率之間的相關關系。

2.3 Chinonin的治療指數(TI)

Chinonin對細胞的半數毒性濃度(TC50)=6.318,抑制抗原分泌HBeAg的半數有效濃度(IC50)=3.322,其治療指數(TI)=1.902。

2.4 Chinonin對鴨乙肝模型DHBV-DNA的抑制作用

鴨乙肝模型經Chinonin治療后,DHBV-DNA水平均有不同程度的降低。其中Chinonin高劑量組在治療10 d后,DHBV-DNA OD值較模型組顯著降低,P<0.05,停藥3d后,即使DHBV-DNAOD值有上升,但與模型組比較仍有顯著差異。Chinonin低劑量組DHBV-DNAOD值也有降低的趨勢。

3 討論

本實驗采用的2.2.15細胞模型及鴨乙肝模型均是研究抗肝炎病毒藥物常用的方法。2.2.15細胞是乙型肝炎病毒基因組轉染的人肝癌細胞HepG2系,其染色體內整合有HBV全基因,可表達乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg),并可分泌有感染性的乙肝病毒顆粒,故2.2.15細胞常用作抗HBV藥物最初的體外篩選模型。鴨乙型肝炎病毒與乙型肝炎病毒同屬嗜肝病毒科,兩者在毒粒形態、結構、基因組成、復制及傳播方式等方面均很相似。DHBV是研究HBV復制機制及篩選抗肝炎病毒藥物的常用模型。本實驗結合體內外實驗來觀察Chinonin的抗乙肝藥效及作用機理,實驗結果顯示,Chinonin對2.2.15細胞分泌的HBeAg有較好的抑制作用,對DHBV-DNA也有清除作用。這提示Chinonin抑制抗原的分泌可能是通過抑制HBV-DNA的復制和病毒的表達來起作用的。

實驗中TI可用來評價藥物臨床應用前景,其中TI>2為有效低毒,1

此外,實驗中Chinonin對HBeAg有較好的抑制作用,而對HBsAg沒有明顯的抑制作用,這在一定程度上可解釋臨床為何HBeAg的陰轉較HBsAg的陰轉容易,這是由于兩抗原的表達存在不同的調控機制,至于其具體的機制尚需進一步的研究。

參考文獻

[1]駱抗先. 乙型肝炎基礎和臨床[M]. 北京:人民衛生出版社,1997:2-3.

[2]黃華藝,鐘鳴,孟剛,等. 芒果甙對大鼠血液過氧化脂質代謝的影響[J]. 中國中醫藥科技,1999,6(2):133-135.

[3]鄭民實,陸仲毅. 芒果甙與異芒果甙的抗單純皰疹病毒作用[J]. 中國藥理學報,1989,10(1):85-90.

[4]丁經業,孫洪發. 藏茵陳抗肝炎有效成分的研究[J].中草藥,1980,11(9):391-392.