論ＤＨＰＬＣ技術在基因突變檢測上的應用

蒙世佼

摘要：DHPLC用來檢測DNA突變和單核酸多態性，可以取代傳統分子生物學技術，不需要制備凝膠，檢測DNA片段做到了全自動、高效、快速、準確，在疾病相關基因突變檢測方面提供了有效的技術手段，是一種快速有效的基因突變篩查方法。

關鍵詞：DHPLC技術；基因突變；檢測

中圖分類號：Q349文獻標識碼：A文章編號：1672-3198(2009)12-0299-01

1DttPLC技術原理

變性高效液相色譜(DHPLC)是一種高通量、自動化的基因突變檢測技術。該技術已在醫學、癌癥、藥物等研究領域開展應用，與SSCP和DNA直接測序等突變檢測技術相比，DHPLC具有靈敏性更高，特異性更強，廉價省時等優點。

DHPLC技術的原理是基于未解鏈的和部分解鏈的雙鏈DNA在部分失活條件下具有不同保留的性質。這種部分失活條件可以采取升高溫度的手段獲得。所有基因組DNA的單拷貝均可通過PCR反應大量擴增，雜合子個體的DNA經擴增產生異源雙鏈，由于錯配位點的氫鍵被破壞，因此在異源雙鏈上形成“鼓泡”，導致它與純合子個體的DNA擴增產物——完全匹配的同源雙鏈的解鏈特征不同。在部分加熱變性的條件下，異源雙鏈DNA分子更易于解鏈形成Y形結構，與固定相的結合能力降低。當流動相中乙腈濃度梯度增大時，異源雙鏈將先于同源雙鏈被洗脫出來，帶有突變序列的樣品呈現出異源雙鏈和同源雙鏈混合物的峰形特點，而不含突變序列的樣品則只有同源雙鏈的峰形。據此可檢測出含有單個堿基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段，從而提供有無突變的信息。

2DHPLC技術在突變基因診斷中的應用

基因突變是指基因組DNA分子在結構功能上發生堿基對組成或排列順序的改變，主要包括堿基的替換和小片段的缺失或插入，它是導致基因型疾病的重要原因之一。基因突變在生物醫學研究中，尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。隨著人類基因組整體測序計劃的發展，探索基因突變的任務變得十分迫切。

隨著人類基因組整體測序計劃的發展，探索基因突變的任務變得十分迫切。DHPLC技術自最早被用于分析人Y染色體單核苷酸多態性位點(SNP)以進行人種進化的遺傳性研究；此后還用于篩查致病基因突變位點、分析單核背酸多態性以及基因啟動子CpG島甲基化修飾改變等研究；因其靈敏性及準確度均較高，操作實現了半自動化，檢測周期短、費用低，尤其適合于基因結構復雜而無突變熱點或突變頻率低于20％的單基因變異，以及多基因致病突變。

(1)散發性卵巢癌p53基因突變定位于17染色體的p53基因是目前研究得最廣泛的抑癌基因，迄今發現的人類腫瘤的2500種基因突變中，p53蛋白的393個氨基酸就有280個位點存在突變，其直接的后果是導致氨基酸的改變，最終使p53蛋白失活，喪失抑癌作用。杜明和豐有吉，利用DHPLC來檢測50例散發性卵巢癌p53基因外顯子5，8的突變，18例突變都可以使用DHPLC的方法發現，沒有假陽性和假陰性。說明DHPLC可以用于臨床篩查基因突變，并且對于異質性腫瘤而言，DHPLC檢測基因突變無疑是最可靠的。

(2)胃癌組織基因突變魯猻、徐惠綿、任群等人利用DHPLC對39例胃癌組織及血清中p53基因突變進行檢測，并測序驗證。在他們的研究中p53基因的突變率為21％(8/39)；其中腸型胃癌突變率40％(6/15)明顯高于彌漫型胃癌8.33％(2/24)(P<0.01)；發現既往未見報道突變3例。這充分說明了DHPLC是一項較好的檢測胃癌組織中基因突變的篩查方法

(3)漢族人I型多囊腎致病基因突變張樹忠等人，通過采用DHPLC技術檢測漢族人常染色體顯性多囊腎病(AD－PKD)I型致病基因PKDl的突變：以來源于19個ADPKD家系的67名成員血樣標本的基因組DNA為模板，通過長鏈PCR和巢式PCR聯合擴增的方法擴增PKDl全編碼區，然后采用DHPLC方法進行初步篩查，將存在異常色譜圖的擴增產物經核苷酸測序，確定突變的具體位點和類型，共檢測出14個致病突變，包括10個錯義突變、1個插入突變、1個缺失突變、2個無義突變。他們實驗結果充分說明了DH－PLC方法可以作為更為有效篩查漢族人ADPKDPKDl突變位點的檢測途徑。

(4)乳腺癌BRCAl基因突變BRCAl基因為“乳腺癌1號基因”，位于17q21，有22個編碼外顯子。目前已經發現約40％～50％的遺傳性乳腺癌和卵巢癌患者BRCAl基因發生突變。李丹等利用聚合酶鏈反應PCR擴增BRCAl基因，該擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，直接進行DH－PLC分析，從124例乳腺癌患者中共發現9種突變，確定了9種乳腺癌患者可能發生的突變類型，為今后臨床應用DH－PLC對高危人群BRCAI基因進行早期基因檢測提供了9個位點，所有DPHLC檢測顯示峰型異常的樣品經測序證明均存在突變或者SHP，證明該技術陽性檢測率為100％。且具有操作簡單、快速、敏感、準確且經濟等特點。

3DHPLC技術與其他技術在突變基因診斷中的聯合應用

目前在核酸分析領域與HPLC聯用的檢測手段有紫外(ultraviolet photometric detector，UV)、熒光(fluorescencedetector)、質譜(mass Spectrometry，MS)等。其中紫外檢測器(UV)憑借其良好的通用性成為應用最為廣泛的檢測器，但靈敏度不高的弱點使其使用受到一定的限制。在核酸分析和一些突變掃描方法中有時需要更高的靈敏度，這時具有更高靈敏度和選擇性的熒光檢測器成為首選。但是熒光檢測器要求使用熒光標記物，且通常使用的染料如吖啶黃、溴化乙錠是有毒物質。Scalano實驗室開發出SYBR Green，染料不僅具有更好的靈敏度，而且使用更安全。激光誘導熒光是目前靈敏度最高的檢測方法之一。Hecker等采用熒光標記PCR引物、激光誘導熒光方式進行檢測，證明DH－PLC方法可以區別含量相差500倍的兩個等位基因，這使多份樣本的混合檢測成為可能。同時熒光標記單鏈，使色譜圖的解釋變得更加容易。美國Transgenomie公司在WAVEOR核苷酸片段分析系統技術平臺基礎上，開發出一種后熒光檢測技術。在所有分析條件不變的情況下，被檢測的核酸片段經DHPLC分離之后在混合室中與熒光試劑混合，然后進行檢測，不僅可以提高靈敏度上百倍，而且不需要昂貴的熒光標記引物。近年來電噴霧離子化一質譜(EIS－MS)作為一種重要的結構分析工具與IR－RP－HPLC聯用也已應用于核酸分析領域，該聯用技術不僅可以確證被分離的單鏈DNA的成分特性，還可以確證擴增的PCR產物的基因型。眾所周知，在核酸的質譜分析中為了獲得高置信度的分析結果，對分析物進行適當的脫鹽和去除小分子量雜質是必不可少的，這也正是HPLC－MS的魅力所在，但質譜的高成本使該項技術較難推廣使用，

4總結

DHPLC用來檢測DNA突變和單核酸多態性，可以取代傳統分子生物學技術，不需要制備凝膠，檢測DNA片段做到了全自動、高效、快速、準確，在疾病相關基因突變檢測方面提供了有效的技術手段，是一種快速有效的基因突變篩查方法。DHPLC技術也有不足之處：對PCR要求很高；不能直接檢測出純合突變，只能提供個體樣本有無突變的信息，但無法得出具體的突變類型；當有多個片段需要檢測時，由于有多個解鏈溫度，需要多步檢測，增加了工作量等。盡管如此，在目前的檢測手段中，DHPLC仍是一種快速、高效、準確、經濟及半自動化篩查基因雜合突變的工具，優于測序等其他分子生物學方法，相信在未來的基因組學研究領域中必將繼續發揮重要的作用。