大別山石斛外植體的選擇與組織培養技術研究

任啟闖

（六安職業技術學院建筑系，安徽 六安 237158）

大別山石斛 ［Dendrobium dabieshanense（C.Z.Tang et S.J.Cheng）］屬蘭科石斛屬。為多年生草本植物，喜溫暖濕潤的半陰環境，不耐寒。生長適宜溫18～28℃，生長期以16～30℃更為合適，休眠期溫度12～16℃。忌干燥、怕積水。是常用中藥材，含有多種生物堿、多糖、抗癌菲，具有抗腫瘤、增強機體免疫力等作用［2］。因為具有很好的保健作用，是 《本草綱目》上的九大仙草之一，素有 “中華仙草”之美稱，被國際醫療植物界譽為 “植物大熊貓”［2］。因具有免疫調節、延緩衰老等功效，是數十種中醫及保健品的必需原料，目前市場的需求量很大。長期以來，野生石斛繁殖率低，特別是種子繁殖，在自然的狀態下不到5%，再加上所需的生長環境特殊，人工的大量挖掘，目前自然的野生大別山石斛已經極少，因此應用組織培養的方法快速繁殖大別山石斛就成為人們普遍關注的焦點［3］。

1 材料與方法

1.1 材料

某公司種植園內的野生大別山石斛、MS基本培養基、馬鈴薯汁、瓊脂、香蕉汁、食糖等。

1.2 方法

1.2.1 不同外植體對不定芽分化的影響試驗

分別取大別山石斛種子、莖、葉片、花梗，經過多次處理 （特別是種子），即先用70%的乙醇消毒40s后，再用0.1%的升汞消毒3min，再用無菌水沖洗4～5次。處理后，分別接種在含有相同激素的培養基上培養。每48h觀察1次，40d后對分化率進行統計分析。

1.2.2 不同生長素對不定芽分化的影響試驗

將大別山石斛的外植體 （種子）分別接種到含有2，4－D、IAA、NAA、IBA的培養基上，生長素濃度為0.1mg／L。培養40d后統計不定芽分化率，分析最適宜的生長素種類和濃度。

1.2.3 不同大量元素對不定芽分化的影響試驗

將大別山石斛的外植體 （種子）分別接種到含有大量元素的 MS、1／4MS、1／2MS的培養基上，40d后統計分化率，找出最適宜的大量元素培養基。

1.2.4 2，4－D、IBA、IAA、NAA對生根的影響試驗

采用4因素3水平正交設計 （表1）［3］。每試劑瓶接種1個約2.3cm長的幼芽，每個處理接種18瓶，重復3次，40d后統計根長、根數和生根率。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.5 不定芽增殖的適宜培養基選擇

在不定芽分化試驗中，在培養基中分別添加5、10、15、20g／L的馬鈴薯汁與沒有添加的進行對比試驗，以選擇培養基中更適合不定芽分化的馬鈴薯汁添加濃度；在培養基中分別添加6、8、10、12g／L的瓊脂與沒有添加的進行對比試驗，以選擇培養基中更適合不定芽分化的瓊脂添加濃度；在培養基中分別添加不同含量的食糖進行對比試驗，以選擇對不定芽的分化作用效果明顯的食糖濃度；對于pH，參照文獻 ［1］分別采用pH5.4、5.6、5.8、7.0的培養基，選擇作用效果最好的pH。根據上述試驗結果最后進行綜合試驗，確定培養基中最有利不定芽分化的各成分濃度。

1.2.6 試管苗生根的適宜培養基選擇

在上述試驗所得的1／2MS＋瓊脂8g／L＋食糖30g／L，pH5.6的基礎上，參照文獻 ［3］不使用馬鈴薯汁，而換成3、5、10g／L的香蕉汁與沒有添加的進行對比試驗，同時與添加相同濃度的馬鈴薯汁進行對比試驗，以選擇生根培養基中香蕉汁的最適添加濃度。根據上述試驗結果最后進行綜合試驗，確定培養基中最有利試管苗生根的各成分濃度。

2 結果與分析

2.1 不同外植體對不定芽分化率的影響

在其他條件一致的情況下，采用不同的外植體 （種子、莖、葉片、花梗），接種在培養基上，觀察不定芽的分化。結果表明，經過處理的種子在25d后分化出芽，分化率較高；莖在20d后四周膨大，形成愈傷組織并分化出芽；葉片在35d才開始有所反應；花梗在26d后四周膨大，有愈傷組織形成，并開始分化出芽。經過40d培養后，各處理批的出芽統計結果顯示:在自然狀態下很難發芽的種子，在培養基上出芽率最高；莖次之；葉片最差。說明不同的外植體在不定芽分化率上差異極顯著 （表2）。

2.2 不同種類生長素對不定芽分化率的影響

在其他條件一致的情況下，將外植體接種在含有不同的生長素 （2，4－D、IAA、NAA、IBA）的培養基上，經過40d培養后，各處理批的出芽統計結果顯示:0.1mg／L IBA作用于外植體對不定芽的分化效果最好，分化率為85%。2，4－D次之，分化率為65% （表3）。

表2 不同外植體下的不定芽分化率

表3 不同生長素下的不定芽分化率

2.3 不同大量元素對不定芽分化率的影響

在其他條件一致的情況下，采用不同大量元素含量的培養基進行分組接種試驗，經過40d培養后，各處理批的出芽統計結果顯示:在1／2MS培養基上的出芽率最高，達到90%，而且數量很多。在MS培養基上的出芽率最低，只有40%，差異達到極顯著水平 （表4）。由此可知，大別山石斛在含有大量元素1／2MS培養基上更加適合不定芽分化。

表4 不同大量元素含量下的不定芽分化率

2.4 IBA、2，4－D、IAA、NAA對外植體生根的影響

IBA、2，4－D、IAA、NAA對外植體生根的影響試驗結果見表5。從表5可知，第3處理批生根率最高，達到100%；而第2處理批次之，達到70%；最低的是第9處理批，只有20%。從平均生根數來分析，第2處理批最多，達到12.52條；第二的是第6處理批，達到7.38條；最差的是第8處理批，只有2.25條。從生根的平均長度來分析，第5處理批最長，5.18cm；第9處理批最短，只有1.62cm。由此結果可知，不同種類的生長素及不同的濃度對外植體生根的作用是不一樣的，以IBA 0.2mg／L最佳。

表5 生根指標數據分析統計

2.5 不定芽增殖的適宜培養基選擇

上述試驗結果表明，1／2MS更加適合不定芽分化；0.1mg／LIBA作用于外植體對不定芽的分化效果好。在不定芽分化的比較試驗中，分別發現添加10g／L的馬鈴薯汁、添加8g／L的瓊脂、添加30g／L的食糖和pH5.6的培養基對不定芽的分化作用效果最好。綜合上述試驗結果最后進行綜合試驗，確定不定芽增殖的適宜培養基為:1／2MS＋馬鈴薯汁10g／L＋IBA0.1mg／L＋瓊脂8g／L＋食糖30g／L，pH5.6；

2.6 試管苗生根的適宜培養基選擇

由2.4可知激素用IBA 0.2mg／L最佳；在上述試驗確定的1／2MS＋瓊脂8g／L＋食糖30g／L，pH5.6的基礎上，采用3、5、10g／L的香蕉汁與沒有添加的進行對比，同時與添加相同濃度的馬鈴薯汁進行對比，結果顯示添加香蕉汁5g／L對試管苗生根作用效果明顯。綜合上述試驗結果最后進行綜合試驗，確定最有利試管苗生根的培養基為:1／2MS＋香蕉汁5g／L＋IBA0.2mg／L＋瓊脂8g／L＋食糖30g／L，pH5.6。

3 結論與討論

從遺傳學的角度看，植物細胞具有全能性，組織培養取任何部分的外植體都可以在一定的條件下培養成植株。但本研究結果表明:在自然界很難萌發的大別山石斛種子，在組織培養的條件下，發芽率在95%以上，其次是莖，而葉片誘導效果最差。

經過不同成分的對比試驗和最后的綜合試驗確定，不定芽增殖的適宜培養基為:1／2MS＋馬鈴薯汁10g／L＋IBA0.1mg／L＋瓊脂8g／L＋食糖30g／L，pH5.6；最有利試管苗生根的培養基為:1／2MS＋香蕉汁5g／L＋IBA0.2mg／L＋瓊脂8g／L＋食糖30g／L，pH5.6。

［1］傅玉蘭，谷鳳.霍山石斛組培快繁殖技術研究 ［J］.安徽農業科學，2004，32（3）:305－306.

［2］金青，馬紹望，洪薩麗，等.霍山石斛原球莖的誘導及培養方式對原球莖增殖的影響 ［J］.安徽農業大學學報，2008，（2）:45－46.

［3］白美發，黃敏.鐵皮石斛組培技術研究 ［J］.安徽農業科學，2008，36（36）:15802－15803.

［4］鄭寬瑜，鄧君浪.鐵皮石斛組培快繁技術體系研究 ［J］.云南農業科技，2009，（增刊）:57－58.

［5］戴小英，張淑霞.鐵皮石斛不同外植體組培快繁技術比較研究 ［J］.中國農學通報，2011，27（10）:122－126.

［6］江建銘，俞旭平.金線蓮組培快繁技術研究 ［J］.時珍國醫國藥，2009，20（2）:408－409.

［7］黃天偉，李偉，李明，等.二色胡枝子組培再生體系優化的研究 ［J］.河北林果研究，2009，24（2）:117－118.