苦豆和狼牙刺種子中苦參堿與氧化苦參堿含量的分析比較

江 珊 韓 豪 江 海 田 姍

摘要建立分析測定苦豆和狼牙刺種子中苦參堿與氧化苦參堿含量的高效液相色譜法,并對其含量進行測定、分析、比較。結果表明:該色譜法能用于苦豆和狼牙刺種子中苦參堿和氧化苦參堿含量檢測,并測得其含量在苦豆和狼牙刺種子中各有優勢;狼牙刺種子在氧化苦參堿制備方面有利用價值。

關鍵詞苦豆;狼牙刺種子;苦參堿;氧化苦參堿;含量

中圖分類號R284.1文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0017-02

苦豆(Sophoraalopecuroides L. )為豆科植物苦參的種子,又名苦參實、苦參子。廣泛分布于我國青海、甘肅、陜西、寧夏、內蒙古等省區。主要含有苦參堿、氧化苦參堿,具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效[1-2]。

狼牙刺(Sophora viciifolia H.)為豆科槐屬多年生灌木,又名白刺花,廣泛分布于我國的河北、山西、陜西、甘肅、河南、四川、云南、貴州等省區。狼牙刺作為一種秦巴地區廣泛使用的民間藥材,已有悠久的歷史。據檢測分析,其種子中含有苦參堿(Matrine)、氧化苦參堿(Oxymatrine)等多種生物堿[3-5]。

現代藥理研究表明,以苦參堿、氧化苦參堿為代表的苦參類生物堿具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗心律失常、免疫調節和升高白細胞等作用[6-11]。漢中為苦豆和狼牙刺的適宜生長區之一,野生資源十分豐富。本文采用高效液相色譜法,對漢中野生苦豆和狼牙刺種子中的苦參堿、氧化苦參堿含量進行了測定、分析,旨在建立一種分析測定苦豆和狼牙刺中苦參堿與氧化苦參堿的高效液相色譜法,并探討苦參堿與氧化苦參堿含量的差異,為合理開發利用苦豆和狼牙刺種子資源提供科學依據。

1材料與方法

1.1供試材料

苦豆和狼牙刺種子均采自陜西省漢中市西鄉縣桑園鎮,于105℃烘箱內烘干、粉碎,過40目分樣篩,備用。

1.2儀器

液相色譜儀(Agilent 1100,安捷倫公司);超聲波清洗儀(SK-120E,寧波科生儀器有限公司);紫外-可見分光光度計(UV-2550,島津公司);超純水器(TTL-10A,北京同泰聯科技發展公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(山東濰紡醫藥集團股份有限公司醫療器械廠);中草藥粉碎機(FW117,天津市泰斯特儀器有限公司);十萬分之一分析天平(AUW220D,島津公司);萬分之一電子天平(FA2004N,上海分析儀器);恒溫水浴鍋(HWS-5A,北京東方精瑞發展有限公司)。

1.3試劑

甲醇為色譜純;氨水、氯仿、磷酸為分析純;水為超純水;對照品苦參堿(110805-200306)、氧化苦參堿(0780-200004)購于中國藥品生物制品檢驗所。

1.4色譜條件

色譜柱ZORBAX -C18柱(4.6mm×150mm,5μm);檢測波長為220nm;流動相為0.04 moL/L磷酸-甲醇(90∶10);流速為1.0mL/min;柱溫為20℃。

1.5對照品溶液的制備

分別精密稱定苦參堿對照品2.4mg和氧化苦參堿對照品10.8mg,用超純水定容至10mL容量瓶中,制成含苦參堿2.4μg/mL及氧化苦參堿10.8mg/mL的混合對照品母液。

1.6供試品溶液的制備

精密稱取試驗材料0.5g,置于60mL具塞三角瓶中,加入2mL濃氨水使樣品潤濕,再加入30mL氯仿,超聲提取30min,靜置4h,濾出上清液后再加氯仿超聲提取,共提取3次。合并3次濾液,80℃水浴回收氯仿至干。殘留物以超純水溶解,并定容于25mL容量瓶。

2結果與分析

2.1檢驗波長選擇

取苦參堿和氧化苦參堿對照品適量,分別用超純水配成標準溶液,在UV-2550紫外-可見分光光度計上于190~900nm進行掃描。結果顯示,苦參堿和氧化苦參堿在220nm處有最大吸收,試驗采用220nm為檢驗波長。

2.2出峰時間確定

在上述色譜條件下,分別進1.5中配制的標準溶液各10μL,檢測得苦參堿在4min處出峰,氧化苦參堿在9min處出峰。

2.3線性關系的考察

精密量取混合對照品母液0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.00 mL、3.00mL用超純水定容至5.0mL容量瓶,得到苦參堿濃度梯度為12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL、96μg/mL、192μg/mL和氧化苦參堿濃度梯度為54μg/mL、108μg/mL、216μg/mL、432μg/mL、648μg/mL的一組混合對照品溶液。經0.45μm微孔濾膜濾過,在色譜設定條件下依次進樣10μL測定苦參堿、氧化苦參堿的峰面積。以進樣濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,得線性回歸方程。苦參堿的方程為Y=5.013 7 X+7.814,r=0.999 70;氧化苦參堿的方程為Y=5.499 X+4.53,r=0.999 92。結果見圖1。供試品溶液經0.45μm微孔濾膜過濾后,在設定色譜條件下,取供試品溶液10μL進樣測定。結果見圖2。

2.4 精密度試驗

精密吸取上述供試樣品溶液10μL,連續進樣5次,利用外標法測定樣品中苦參堿、氧化苦參堿濃度,RSD分別為0.245%、0.204%。

2.5穩定性試驗

精密吸取上述供試樣品溶液10μL,分別在2h、4h、8h、24h、48h進樣,測定苦參堿、氧化苦參堿的濃度,RSD分別為0.326%、0.204%。結果表明,供試品溶液中的苦參堿、氧化苦參堿在48h內穩定。

2.6重現性試驗

取同一材料,按供試品溶液的制備方法平行制備5份,依上述方法測定苦參堿、氧化苦參堿濃度,RSD值分別為0.404%、0.311%。

2.7回收率試驗

精密稱取已測定苦參堿、氧化苦參堿含量的樣品5份,每份0.5g,分別加入定量的苦參堿、氧化苦參堿,按供試品溶液的制備方法制備,測定,結果如表1。得苦參堿的平均回收率為100.990%,RSD值為2.122%;氧化苦參堿的平均回收率為99.180%,RSD值為0.098%。

2.8樣品含量測定

分別取苦豆和狼牙刺種子為試驗樣品,按供試樣品溶液制備的方法處理樣品。分別精密吸取各供試樣品溶液10μL,進樣分析檢測,計算得苦豆和狼牙刺種子中苦參堿和氧化苦參堿含量(見表2)。

3討論

3.1色譜條件

試驗分別用0.2%鹽酸提取法、甲醇提取法和氨水-氯仿提取法,結果發現采用0.2%鹽酸提取法在蒸干時困難;甲醇提取法出現絮狀物,檢測困難;氨水-氯仿提取法溶液澄清,重復性好。

分別采用甲醇、乙醇、超純水定容對照品和樣品材料的提取物,進行分析測定。用超純水定容的待測樣色譜圖基線穩定,峰形對稱,重復性、穩定性良好,可用于定性、定量分析檢測,為本試驗最終選擇。

試驗采用酸性流動相,出峰時間短,且隨流動相pH值的減小,峰形對稱性越好,基線越平直。考慮到酸性對設備的使用壽命的影響,最終采用0.04moL/L磷酸溶液(pH值1.8)-甲醇為流動相,并采用能耐受酸性環境的ZORBAX-C18(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱,檢測效果良好。

3.2含量分析比較

從苦豆和狼牙刺種子中的苦參堿和氧化苦參堿含量測定結果可以看出,狼牙刺種子更具優勢。在制備以苦參堿和氧化苦參堿為主的生物產品時,可以適當考慮用狼牙刺種子作為材料。苦豆作為一種中藥材已有廣泛運用,狼牙刺種子苦參類生物堿雖然含量高,但能否可當作廣泛使用的中藥材還需進一步研究。

4參考文獻

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