上海市腸炎沙門菌流行特征和分子分型研究

許學斌　袁政安　金匯明　肖文佳　顧寶柯　陳　敏　冉　陸　刁保衛　崔志剛

(1.上海市疾病預防控制中心, 上海200336;2.中國疾病預防控制中心, 北京100050）

摘要[目的]分析上海市2006—2007年的腸炎沙門菌株，了解本地區腸炎沙門菌的分子流行病學特征。[方法]回顧2002—2007年腸炎沙門菌食品株的來源并與腸炎沙門腹瀉株作耐藥性比較；對2006—2007年全球沙門菌監測（GSS）病例和食品分離的腸炎沙門菌進行表型驗證、藥敏試驗和脈沖凝膠電泳（PFGE）分析。[結果]2006—2007年腸炎沙門菌在本市非傷寒沙門菌病例中列首位，而80%的食品株源自禽及禽肉制品，食品株的抗生素耐藥性高于腹瀉株。2007年腸炎沙門菌腹瀉株的耐藥譜和2006年有較大差異。包括13株食品株在內共76株腸炎菌株可分為21種PFGE帶型，遺傳同源性接近80%，優勢帶型依次為3型（34株）、1型（12株）、2型（5株）和5型（5株），除2型外均發現有與腹瀉株同型的食源株。2006和2007年的PFGE1/2型病例分別為4例和12例。[結論]上海市腸炎沙門菌病例和食用污染的雞肉等禽類制品有密切關系，PFGE3型腸炎沙門菌是目前上海市腸炎沙門流行株的優勢菌型，2007年發現由鵝肝傳播的1/2型腸炎沙門菌可能是3型的變異株并有取代成為流行菌株的趨勢。開展對腹瀉病例和食物鏈的綜合監測和以實驗室為主的實時分子分型檢測能快速預警腸炎沙門菌散在爆發和追溯污染源。

［關鍵詞］腸炎沙門菌；脈沖凝膠電泳；分子分型；爆發；污染源

Study on the epidemiological character and molecular typing of Salmonella enterica serovar Enteritidis in ShanghaiXU Xue-bin1，YUAN Zheng-an1, JIN Hui-min1，XIAO Wen-jia1,GU Bao-ke1，CHEN Min1，RAN Lu2，DIAO Bao-wei2，CUI Zhi-gang 2（1.Shangahi Center of disease Control and Prevention，Shanghai 200336，China；2.China Center of Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：［Objictive］ To study the molecular epidemiological characteristics of Salmonella enterica serovar Enteritidis（S. Enteritidis）strains in Shanghai from 2006 to 2007.［Methods］ A retrospective analysis from 2002 to 2007 was performed to explore the source of food-borne S. Enteritidis strains and compare its antibiotic resistance with strains isolated from diarrhea patients.Data of S. Enteritidis strains of patient and food of Global Salm-Surv(GSS) from 2006 to 2007 were tested;including phenotype confirmation,antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) analysis.［Results］S. Enteritidis was the topmost strains in diarrhea patients caused by non-typhi Salmonella in 2006 to 2007,in Shanghai. 80% strains of food-borne S. Enteritidis were obtained from poultry and its meat products.The antibiotic resistance of food isolates was higher than clinical isolates. The drug resistance spectrum of diarrhea patients isolates in 2006 was different from that in 2007.76 strains including 13 food-borne strains belong to 21 PFGE pattern combinations,and their genetic similarly was higher than 80%. The major PFGE subtype was 3(34strains),1(12 strains),2(strains)and 5(strains),Every strains from food has matched PFGE subtype strains in diarrhea patients except subtype 2. The number of homology case of diarrhea patients and food caused by subtype 1/2 were 4 and 12 in 2006 and 2007.［Conclusion］ There is close relation between the diarrhea patients of S. Enteritidis and the contaminated poultry(chicken) in Shanghai.The PFGE subtype 3 is the dominant epidemic strains.The PFGE subtype 1/2 isolated from goose liver in 2007 may be the virieties of subtype 3,and they may tend to replace the dominant strains.The study suggested that rapid control and forecast the potential outbreak cases of S. Enteritidis and trace the suspected contamination source by combine the surveillance of clinical patients and food chain,including the real-time molecular typing in laboratory.

Key words：S. Enteritidis; PFGE; Molecular typing; Outbreak; Contamination source

從1995年以美國疾病預防控制中心（CDC）為主的多國、多部門合作建立的細菌分子分型國家電子網絡（PulseNet）監測體系開始，由非傷寒沙門菌引發的許多公共衛生事件就被各種傳媒廣泛報道而影響到全球范圍的相關食品貿易。作為我國經濟、貿易發達地區，上海于2006年加入非傷寒沙門菌的全球監測網絡（GSS），完成2年的監測發現，腸炎沙門菌（血清型）是造成本市非傷寒沙門菌的感染性腹瀉病例和食源性疾病的優勢菌型。為研究腸炎沙門菌在本市的爆發和流行趨勢，本研究通過對腸炎沙門菌食源株的回顧性分析和對2006—2007年GSS腸炎沙門菌腹瀉菌株進行抗生素耐藥和脈沖凝膠電泳（PFGE）分析，以了解本市腸炎沙門菌的分子流行病學特征，為本市的非傷寒沙門菌監測和防治提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗菌株實驗菌株有2002—2007年食源性腸炎沙門菌48株和2006—2007年GSS病例分離的腸炎沙門菌84株；藥敏試驗的腸炎沙門菌204株，包括2005年67株腹瀉株、2006年8株體檢株、2006—2007年84株GSS腹瀉株和45株食品株；PFGE分析腸炎沙門菌76株，包括2006—2007年GSS監測的13株食品株和63株GSS腹瀉株；大腸埃希菌ATCC25922為藥敏試驗質控菌株；產超廣譜?-內酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯桿菌ATCC700603；本中心菌種保藏室提供的布倫登盧普沙門菌H9812作為PFGE的分子質量標準菌株。

1.1.2培養基改良亞硒酸磺綠增菌液（MSBG）、羅伯特增菌液（RVS）、木糖賴氨酸膽酸鹽瓊脂平板（XLD）、CHROMagar?沙門菌顯色瓊脂平板（CAS）、M-H瓊脂平板均購自上海科瑪嘉科技有限公司，腸道雙支糖綜合鑒別管和其他輔助生化鑒定試劑由本中心供應室配置。以上增菌液和平板均于避光10℃以下保存，在有效期內使用。

1.1.3 試劑和儀器沙門菌分型診斷血清50種（成都生物制品研究所）、沙門菌分型診斷血清79種（S＆A，Ltd，泰國）；藥敏分配器和16種抗生素紙片：四環素（TET）、頭孢噻夫（EFT）、奧格門丁（AMC）、氨芐西林（AMP）、復方新諾明（SXT）、環丙沙星（CIP）、氯霉素（C）、氧氟沙星（OFX）、萘啶酸（NA）、頭孢吡肟（FEP）、頭孢噻肟（CTX）、甲氧芐氨嘧啶（W）、頭孢他啶（CAZ）、慶大霉素（CN）、磺胺甲異惡唑（S3）、鏈霉素（S）（Oxoid，英國）；Etest頭孢噻肟及頭孢噻肟含克拉維酸紙條和11種含抗菌藥物紙條（AB biodisk，瑞典）；VitekAM-60自動生化鑒定儀和菌液比濁儀（生物-梅里埃，法國）；限制性內切酶XbaⅠ（TaKaRa，日本）；SeaKem Gold瓊脂糖（Cambraex Bio Rockland，美國）；脈沖凝膠電泳儀CHEF mapper system和凝膠成像系統GEL Doc2000（Bio-Rad，美國）；血清和抗生素紙片均在有效期內使用。

1.2實驗方法

1.2.1食品樣品非傷寒沙門菌檢測根據文獻方法［1］和2007年制定《上海市沙門菌病監測方案》中食品檢測程序完成樣品處理、分離初篩、菌株鑒定和血清分型等，生化反應符合并且血清抗原式符合［9:g,m:-］者鑒定為腸炎沙門菌。

1.2.2非傷寒沙門菌病例（GSS）監測按照文獻方法［2］和《上海市沙門菌病監測方案》中糞便樣品檢測程序完成對樣品分離、初篩鑒定和血清分型，生化反應符合并且血清抗原式符合［9:g,m:-］者鑒定為腸炎沙門菌。

1.2.3抗生素敏感性試驗參照CLSI（NCCLS）2005年操作規程采用改良K-B法并根據抑菌圈直徑判斷敏感（S）、中介（I）、耐藥（R），抑菌圈范圍在中介者并入R統計值； ESBLs菌株測試以頭孢噻肟作為初篩試驗，抑菌圈直徑≤27mm者為疑似ESBLs，確認試驗使用Etest測試條檢測頭孢噻肟和頭孢噻肟-克拉維酸復合劑，若當克拉維酸存在比無克拉維酸時的MIC降低大于4個稀釋梯度可判斷為產生ESBLs［3］。ESBLs菌株最低抑菌濃度（MIC）用Etest法測定11種抗生素。

1.2.4 PFGE按照GSS方案要求，在中國CDC國家腸道病重點實驗室按照PulseNet規定的PFGE標準方法對76株腸炎沙門菌進行凝膠電泳、圖譜分析和BioNumerics（Version 4.0）軟件聚類分析。

2 結果

2.1食源性腸炎沙門菌

從食品中分離腸炎沙門菌48株，包括2002—2005年的35株和2006—2007年的13株。其中來源于雞、鴨等禽肉制品為32株（80.0%，32/48），其次分別來源于豬、牛等畜肉制品8株、奶制品3株、豆制品2株、水果2株、蔬菜1株。

2.2GSS監測腸炎沙門菌病例

2006年從GSS病例分離到腸炎沙門菌44株（22.4%，44/196），高峰期在8月；2007年從GSS病例分離到腸炎沙門菌40株（23.7%，40/168），高峰期在8、9月間。2年中腸炎沙門菌在非傷寒沙門菌腹瀉病例的血清型構成中均占首位，2年內與月度分離菌株數對應的流行趨勢見圖1。

2.3腸炎沙門菌抗生素耐藥率

204株腸炎沙門菌分別來自腹瀉病人（151株）、體檢（8株）、食品（45株）。腸炎沙門菌臨床株對氟喹諾酮類的氧氟沙星、環丙沙星和復方新諾明、氨芐西林、奧格門丁的耐藥率低于食品株，差異有顯著性（χ₂>3.8，P<0.05）；體檢株對大多數抗生素全部敏感，僅對四環素、利福平、鏈霉素、萘啶酸存在不同程度耐藥；食品株對萘啶酸、頭孢噻吩的耐藥低于臨床株，兩者差異有顯著性（χ₂>3.8，P<0.05），多重耐藥菌株的比例高于前兩者。臨床株耐藥率自2007年始發生較大變化，其中對四環素、氨芐西林、磺胺甲異惡唑、鏈霉素的耐藥率出現了較大幅度的增高，對萘定酸的耐藥率則出現了下降（圖2）。有2株經Etest篩選后確認為ESBLs菌株分別是2006年的臨床株和食品株，對氨芐西林和第一代頭孢菌素（頭孢噻吩）的抑菌濃度大于256mg/ml，在第三代頭孢菌素中對頭孢噻肟和頭孢三嗪的抑菌濃度均大于256mg/mL，僅泰能敏感。禽肉株的耐藥值大于臨床株（表1）。

2.476株腸炎沙門菌株的PFGE分型

76株腸炎沙門菌共分為21種帶型。63株臨床株分15個帶型，優勢帶型為3型（49.2%，31/63）和1型（17.5.0%，11/63），2型和5型各5株，4型、6型和34型各2株，其他型均僅有1株。1型與2型的差異較小，同源性達98%，與3型、4型也有90%的同源性。13株食源性菌株除1株自胡蘿卜、1株自豬肝分離外，其余11株有10株自雞肉制品分離，有1株自鴨肉制品分離。食源菌株的帶型分10種，和臨床株能完全匹配的型別有4個帶型（6株菌），分別是1型（1株）、3型（3株）、4型（1株）、5型（1株），其余6個帶型（7株菌）相對獨立。所有來源自病人和食品的腸炎沙門菌聚類圖譜顯示菌株間的遺傳同源性接近80%（圖3）。

3 討論

GSS是以腹瀉病例監測為基礎重點針對非傷寒沙門菌引起的“散在爆發”案例開展相關的食源性溯源調查研究的全球合作項目，項目初始階段我們對方案和設立的監測點完成對現場信息采集和實驗室標準化檢測流程的質量控制和初步評估，隨后需要重點分析能造成“多點”或“局部”流行的個別優勢血清型的分子流行病學特征［4］。腸炎沙門菌是最早發現能夠引起大規模食物中毒的非傷寒沙門菌血清型之一，也是近年我國沙門菌食物中毒爆發和流行案例的主要病原。從本次GSS報告的腸炎沙門菌株月報表所繪制的流行曲線觀察（圖2）：2006年本市監測到的腸炎沙門菌檢出數頻率變化較大，高峰為12株，2007年的曲線變化小，但檢出高峰在流行季節持續時間相對較長；從菌型構成分析：2005年本市監測的腸炎沙門菌株總數次于鼠傷寒沙門菌排第二位，而2006-2007年則超過鼠傷寒沙門菌排在首位，這種型別交替的現象通過2008年的GSS年度報告證實這在全球GSS網絡中具有共性特征。

高度散發的腸炎沙門菌株（病例）之間的關系以及是否可能和被污染的食品之間形成潛在的食源性危險因素是本次個案研究的重要目的。基于GSS項目系統完整的菌株資源并整合本市非傷寒沙門菌血清型監測的歷史數據回顧性分析48株食源性腸炎沙門菌：80%的腸炎沙門菌源于禽肉制品，特別是雞肉制品（包括超市和農貿市場的生鮮和冷凍、定型和非定型包裝產品）陽性檢出率遠遠高于其他種類的食品。這種具有優勢的統計結果至少說明在加工和銷售過程中頻頻被污染的雞肉制品是本市腸炎沙門菌病例的重要“媒介”，這為食品衛生監督部門如何對大型超市、集市及餐飲場所做好生鮮食品的分割或料理的安全控制管理和在企事業單位食堂或家庭宴請時強調“生熟分開”提供了科學的管理依據。

耐藥表型監測在PulseNet監測中的意義具體表現在—美國食品藥品監督管理局（FDA）通過收集分析食源和腹瀉菌株的耐藥率變遷來及時評估國內外的食品株對本國沙門菌病發病率的影響。根據我們對非傷寒沙門菌的歷史耐藥監測資料得到的結論，食源性沙門菌的耐藥率水平多高于臨床株，尤以萘啶酸和環丙沙星等喹諾酮類抗生素較顯著，而臨床株的耐藥水平也不斷呈上升趨勢［5］。雖然本次腸炎沙門菌株的耐藥表型也基本具有過去的一些耐藥特征，但2007年腸炎沙門菌的臨床株對四環素、氨芐西林、磺胺、鏈霉素耐藥水平升高的變化趨勢我們認為是菌株發生了分子水平的變異并通過表型機制表達出的“拐點效應”。相比之下，食源性腸炎菌株的耐藥率仍雖遠高于臨床株的水平，但和既往的耐藥水平相比已有一定的下降，這在某種程度上反應國家在動物飼料及農產品養殖過程中對某些抗生素濫用所采取的積極控制措施初見效果。ESBLs沙門菌在中國已有多例被發現和報道，本次篩選的2株腸炎沙門菌其產生的CTX基因酶型和公共衛生意義值得進一步的研究［6］。

PFGE圖譜能闡述本地區的腸炎沙門菌分子水平的變化特征：腹瀉株和食品株之間存在共性和個性的PFGE型譜特征。63株腸炎沙門菌臨床株的優勢型分別是3型（31/63）和1/2型（16/63），2006/2007年各有3株食品株（分別為雞肝、雞胸肉、豬心）與3型圖譜完全匹配；2007年有1株鵝肝株與1型圖譜完全匹配。其次，2006年的優勢分子型為3型（15株），1型僅有4株；而2007年雖然也有16株為3型， 但1/2型則有12株，1/2型在2年中所出現型別的顯著性升高說明，PFGE3型在本地區腸炎沙門菌的絕對流行株中仍占主導，但是新出現分子變異的1/2型從2007年開始有逐步替代本地優勢型的流行趨勢。同時該結論和流行病學特征、耐藥表型分析的結果變化之間形成相互驗證。本次使用限制性內切酶XbaⅠ酶切所得PFGE圖譜與中國臺灣學者在1998-2002年的分型結果得到PFGE3型為優勢分子型的結論一致，說明腸炎沙門菌PFGE3型在過去相當長時間里其遺傳特征是穩定的［7］。另比較GSS2008年度報告中廣東省的分型結果顯示，其2007/2008年的腸炎沙門菌的流行株亦為1/2型，和本市的分型特征一致。當然，1/2型最終能否替代3型成為本地或在更大的范圍里成為流行株還需要我們繼續監控和研究。

現階段我們離WHO-GSS要求監測點對沙門菌病例進行時實監測的要求仍有較大差距。但是在2年中我們得到本市沙門菌的發病率等流行病學本底資料，大大提高監測點現場人員的信息采集和流調能力，也幫助臨床實驗室人員提高分離、鑒別沙門菌的能力和與現場人員的溝通能力；還初步證明禽肉制品可能是本市腸炎沙門菌病例的潛在傳染源，而PFGE圖譜證明鵝肝是本市2007年出現的腸炎沙門菌1/2型流行的傳染源。這些現場和實驗室結合的系統性研究模式為繼續做好項目的研究提供了可能的條件，所積累和得到的相關信息能服務和共享于本市的公共衛生保障體系的建設和2010年世博會的衛生保障活動。

4參考文獻：

［1］許學斌,顧寶柯,袁政安,等.富營養預增菌液在肉制品沙門菌常規檢測方法中替代效果研究［J］.中國人獸共患病學報，2006,22(7):633-635.

［2］許學斌,顧寶柯,陳敏,等.沙門菌檢測方法的優化［J］.檢驗醫學，2007,22(6):677-680.

［3］Murray PR,Pfaller MA,Tenover FC.臨床微生物手冊［M］.北京:科學出版社,2005:2209-2224.

［4］顧寶柯,袁政安,金匯明,等.上海市沙門菌病流行特征分析［J］.環境與職業醫學，2008,25(3):245-247.

［5］許學斌,顧寶柯,金匯明,等.免疫磁珠法檢測食品中的沙門菌及分離菌株的耐藥性［J］.中國食品衛生雜志.2006,18(3):202-204.

［6］Cui SH,Li JY,Sun ZY,et.al.Characterization of Salmonella enterica isolates from infants and toddlers in Wuhan,China［J］.J Anti Chem，2008:1093-1099.

［7］Pang JC,Chiu TH,Chiou CS,et.al.Pulsed-field gel electrophoresis,plasmid profiles and phage types for the human isolates of Salmonella enterica serovar Enteritidis obtained over 13 years in Taiwan［J］.J Appl Microbiol，2005,99:1472-1483.

項目基金：中美新發和再發傳染病項目資助［編號：美國疾病預防控制中心（CDC）5U2GGH000018-02］

作者簡介：許學斌（1972—），男，主管技師。（收稿日期：2008-12-24）