哺乳動物卵胞質內單精注射的研究進展

摘要：哺乳動物卵胞質內單精注射技術發展很快，而且已在很多領域發揮其重要的作用。簡單綜述了哺乳動物卵胞質內單精注射(ICSI)的研究概況、存在的問題以及今后的應用前景。

關鍵詞：哺乳動物；卵胞質內單精注射；進展

中圖分類號：Q954.44 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114(2009)01—0236—03

顯微受精是20世紀80年代發展起來的一種新型的體外受精技術。即借助顯微操作儀，將精子直接或精子細胞注入卵母細胞內(或卵周隙)，促使其在體外相互結合的技術，這項新技術是體外受精和顯微操作技術相結合而形成的，也可以說是顯微操作輔助受精，目前顯微受精技術主要有3種途徑：①透明帶開孔技術(PZD)；②卵透明帶下注射技術(SUZI)；③卵胞質內單精注射技術(ICSI)。其中①PZD不為人們接受的主要原因是需要足夠量的精子。⑦SUZI法受精令人失望的缺點是多精受精難以控制。而③ICSI就克服了①PZD和②SUZI的缺點。ICSI是20世紀80年代后期發展起來的一項新型的體外受精技術，它是借助顯微操作儀，將一個精子或生精細胞直接注入卵母細胞胞質內。使精卵結合完成受精的過程。ICSI技術可排除透明帶和卵質膜對精子人卵的阻礙作用。故對精子的死活及其完整性無嚴格要求。因此一躍成為當前顯微受精技術的主流，廣泛應用于畜牧生產、野生動物保護、人類的深度不育和受精機理的理論研究中。

1 哺乳動物卵胞質內單精注射受精的效果

關于卵胞質內單精注射受精的效果，國內外已有很多成功的報道，但是針對不同的哺乳動物而言，還存在一些問題。現簡單綜述如下。

小鼠單精注射的首次嘗試在1983年，但當時的試驗結果很差，因為小鼠卵母細胞的質膜缺乏彈性。直接注射精子時非常容易死亡。Kimura等對顯微操作儀進行了改進，采用Piezo-driven操作系統克服了小鼠卵母細胞的細胞膜抗損傷能力差的特點，使小鼠注射卵的存活率由16％提高到80％，囊胚率由33％提高到68％，產仔率達30％。之后，人們廣泛試驗睪丸精子，精子頭，形態異常精子等各種極端條件處理下精子的受精產仔情況并取得了成功，證明了精子的新鮮度和活動力對ICSI的結果沒有顯著影響。羅軍等報道了兔單精子胞質內注射受精的成功，獲得70％的桑椹胚和囊胚發育率，細胞胚胎移植后，順產4只健康仔兔。Hosoi等將不活動但是活的兔精子注射到兔卵母細胞質內獲得了胚胎，并獲得仔兔，證明了精子的活動力對ICSI的結果沒有顯著影響。Sofikitis報道了兔球形精子細胞核ICSI的成功，并得到仔兔。Liu等將凍干的兔精子注射到卵胞質，妊娠得1只仔兔，由于難產死掉了，這說明死精子也能用于ICSI獲得后代。首例在牛的ICSI上獲得成功的是Goto。將單個的死精子注入牛體外成熟的卵母細胞質內，再將注射卵人工激活。囊胚率達7.8％，獲得2頭ICSI試管牛。盧圣忠將解凍后的牛精子注入牛卵母細胞中。獲得19.9％的受精率和94％的分裂率。Katayose等將Piezo系統引入了牛的ICSI研究，并證明在牛的Piezo-ICSI中注射卵的激活不是必需的。隨后，Wei等也進行了牛Piezo-ICSI試驗，沒有進行注射卵的激活，并成功獲得后代。Ldeta將DTF處理過的精子分別注入M I和MⅡ期的卵子內，體外培養后胚胎分裂率沒有顯著差異，M I卵子的囊胚發育率(18-3％)明顯比MⅡ的低，說明牛的未成熟卵子ICSI效果不如成熟卵子，但是也有應用于ICSI的潛力。尚需進一步研究。牛向麗等進行了水牛和黃牛種間的異種受精研究并取得了較好的體外發育效果。豬的ICSI起步較晚。最早是Hosoi等將豬活精子注入豬卵母細胞的胞質內觀察到原核形成。Martin首次報道體內成熟卵子的ICSI。獲得分裂率為69％，囊胚率達到38％，移植后產下3只仔豬。目前因豬卵母細胞的體外成熟系統不夠完善、胞質脂滴較多而使操作困難以及早期胚胎4-細胞阻滯發育使得豬ICSI整體效率較低，故得到存活后代的報道較少。Gomez將綿羊的精子注入體外成熟的卵母細胞質內，激活率30.6％，囊胚率8.5％，移植后獲得2只正常羊羔。顧文藝和郭志勤將綿羊精子可溶性提取物與單個不運動綿羊精子注入體外成熟的綿羊卵胞質內，囊胚的發育率達到5.1％，證明精子和精子提取物共同注射具有明顯促進胚胎發育的作用。最早的雌雄原核是在ICSI后的2h和3h，IVF后4h形成。ICSI(28.6％)的受精率低于IVF(70.4％)。但是ICSI不正常受精率(8.7％)和IVF(15.2％)的差異不顯著。結果說明，ICSI的受精時間比IVF的早，ICSI后雌雄原核形成的時間不同步。這些結果對提高綿羊的ICSI效率十分有用。但山羊ICSI受精技術還很不成熟，有關方面的研究報道也很少。目前還未見報道有山羊精子經ICSI有后代產生。Li等將注射后的卵子分別用離子霉素、乙醇、噻汞撒、三磷酸肌醇激活，發現這4種化學物質都有顯著提高卵子激活率的作用，其中噻汞撒對提高馬的注射卵激活率和正常受精率的效果比其他幾種激活劑更好，但是化學激活同時也刺激部分卵子發生孤雌分裂。同年，Li等得到了歐洲第一只ICSI試管馬駒，這標志著馬的ICSl已進入一個新的階段，這項成果對馬生殖機理的研究及育種馬的應用有著重要意義。Gallic等經ICSI獲得胚胎冷凍，解凍后移植，有受體妊娠但沒有產仔。目前由于馬的體外成熟系統的限制，從而限制了胚胎以后的發育能力。

Lanzendorf等研究者首次報道了人精子直接注入卵胞質后的原核形成。之后。取得突破性進展的是Palermo等率先用人的卵母細胞上進行ICSI，并成功誕生世界上首例ICSI試管嬰兒，ICSI技術成為了男性不育治療新的里程碑。對于有些男性患者，通常由于精子活力低或無精子而不能進行傳統的體外受精，只能用睪丸內各級生精細胞來進行ICSI實現受精。近期研究結果表明，人睪丸精子細胞的ICSI妊娠率顯著低于射出精子的ICSI妊娠率。現階段對精子細胞的生物條件和應用的臨床并發癥還沒有充分了解，細胞質內精子細胞注射對不育癥的治療有許多爭議，還有許多問題有待研究，盡管如此，目前此方法對于非阻塞性無精癥患者無疑是惟一的選擇。

2 卵胞質內單精注射技術的應用前景及存在的問題

ICSI技術作為輔助受精的一種手段，在近10年獲得長足發展。ICSI技術在動物受精機理研究、野生動物遺傳資源保存、拯救珍稀動物和胚胎工廠化生產等方面有著非常廣闊的應用前景。該技術已經成為人類臨床醫學上治療男性不育癥的重要手段，并在全世界得到廣泛應用。

盡管ICSI已取得很大成就，但是其存在的問題也不容忽視。首先，由于人為地選擇，動物自身對精子優勝劣汰的選擇遭到破壞。這對動物種群的發展產生的影響還需長期深入的研究。如果能詳細了解精子的表型和基因型之間的關系，相信ICSI技術的可靠性會有所明確。其次，作為胚胎生物技術的一部分。ICSI技術也存在總體效率低的問題，而且胚胎移植后妊娠率低而流產率高亦是目前存在的普遍問題。另外，存在出生動物的死亡和畸形等不良后果。因此要更深入地研究其機理和操作等問題，進一步改善ICSI技術。