犬胰島細(xì)胞分離純化實(shí)驗(yàn)研究

賀長軍

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物的選擇:選用成年犬22只,體重約20～30 kg,雌雄不限,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)外科提供。

1.1.2主要試劑:Ficoll胰腺灌注液(HC-A),膠原酶V,胎牛血清(FBS),二苯硫卡巴腙(DTZ),吖啶橙(Acridine Orange,AO),碘化丙啶(Propidium Iodide,PI),分散酶Liberase RPMI,稀釋溶液M199,沖洗溶液CMRL,終沖洗液/培養(yǎng)基,人血白蛋白,DNase I酶,HEPES,HBSS,胰島素放射免疫試劑盒。1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 犬胰腺的獲取以及運(yùn)輸:在全麻下剖腹,打開腹腔,在胰腺周圍撒入冰屑,于腎動脈開口下方之腹主動脈上系兩跟細(xì)線,遠(yuǎn)端結(jié)扎,在近端側(cè)用剪刀剪一小口,插入灌注管,在膈肌上方將胸主動脈結(jié)扎,用冷的HC-A快速灌注,用量約為1 500毫升,同時(shí)打開下腔靜脈,排出血液。觀察腹腔各器官,當(dāng)顏色呈均勻灰白色,靜脈流出液清亮而不帶血色時(shí),表示灌注成功。待胰腺灌注完成后,連同十二指腸一并將胰腺切下,放入周圍有冰屑的胰腺容器中,運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 犬胰腺的初剪以及灌注:在超凈臺內(nèi)將胰腺從無菌的胰腺容器中取出,抽取2毫升保存液進(jìn)行微生物檢測。放入預(yù)先倒入Hanks平衡液的初剪盤上,初剪盤置于冰屑上。

切除十二指腸及較多脂肪和筋膜組織,進(jìn)行初剪。同時(shí)注意胰腺的大小,有無損傷,灌注的效果如何。第1個(gè)燒杯中倒入10% betadine溶液,第2個(gè)倒入二性霉素B溶液,第3個(gè)倒入冷的HBSS液各500ml。將修剪的胰腺放入第1個(gè)燒杯,清洗并控出多余液體,然后浸入第2個(gè)燒杯,最后在第3個(gè)燒杯中清洗。將胰腺放入稱重瓶中進(jìn)行稱重并計(jì)數(shù),移入另一超凈臺中進(jìn)行灌注。

在制冷的循環(huán)剪切盤上進(jìn)行灌注,冷循環(huán)剪切盤中加入冷的Euro Collins (100 ml)。……