川芎嗪對胃癌細胞及血管內皮細胞增殖的影響

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(1.廣東藥學院 中山校區實驗中心，廣東 中山 528458；2.廣州中醫藥大學 實驗動物中心，廣東 廣州 510405)

胃癌是一種常見的對人類危害較大的疾病，我國在20世紀90年代進行的全國惡性腫瘤死亡率調查表明，胃癌死亡率高居惡性腫瘤死亡率的首位[1]，目前使用手術、化療、放療等治療方法存在許多局限，而且不能有效防治胃癌的轉移和復發。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從活血化瘀中藥川芎中分離得到的一種生物堿，主要應用于缺血性心、腦血管疾病，毒副作用少。有研究發現[2]，川芎嗪對MKN45人胃癌低分化腺癌細胞有直接的殺傷作用；張薇等[3]的研究則顯示川芎嗪能抑制胃癌前病變大鼠新生血管生成，可能對胃癌具有一定的預防和治療作用。本文擬通過MTT比色法觀察川芎嗪對胃癌細胞和血管內皮細胞增殖的影響，初步探討川芎嗪在胃癌治療中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 材料 RMPI 1640培養基(美國Gibco)，SFM培養基(美國Gibco)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，谷氨酰胺(美國Amresco，博理分裝)，重組人β內皮細胞生長因子(rhβ-ECGF,美國R&D)，F8兔抗人多克隆抗體、FITC-羊抗兔IgG(武漢博士德)，鹽酸川芎嗪注射液(常州制藥廠有限公司，規格：40 mg/2 mL，批號：0403231)，MTT(美國Amersco，博理分裝)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌細胞培養 SGC-7901胃腺癌細胞(購自中國科學院上海細胞庫)，用RMPI 1640完全培養基(加入10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺)培養。

1.2.2 HUVEC培養 采用胰蛋白酶消化法分離獲取[4-5]。用內皮細胞培養基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1 ng/mL rhβ-ECGF的SFM培養基)培養，傳代后用第八因子相關抗原免疫熒光染色法進行鑒定。HUVEC第3～6代用于實驗。

1.2.3 川芎嗪對細胞增殖影響的檢測

1.2.3.1 對胃腺癌細胞增殖的影響 SGC-7901胃腺癌細胞以1×104個/mL的密度接種于96孔板內，每孔接種100 μL，用RMPI 1640完全培養基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺)培養。培養24 h后，吸棄孔中培養基。每塊培養板分4組，每組6個復孔。正常對照組加入100 μL/孔RMPI 1640完全培養基；川芎嗪組則將含川芎嗪25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的RMPI-1640培養基依次加入相應的孔中，每孔100 μL。藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況(檢測490 nm處光吸收值)。

1.2.3.2 對無因子培養HUVEC細胞增殖的影響 HUVEC以2×104個/mL的密度接種于96孔板內，每孔接種100 μL，用SFM完全培養基(含10%胎牛血清和2 mM谷氨酰胺)培養。培養24 h后，吸棄孔中培養基。每塊培養板分4組，每組6個復孔。正常對照組則加入100 μL/孔SFM完全培養基；川芎嗪組則將含25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的SFM完全培養基依次加入相應孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況(檢測490 nm處光吸收值)。

1.2.3.3 對胃腺癌細胞條件培養基誘導的HUVEC增殖的影響 胃腺癌細胞接種于75 cm2培養瓶內，每瓶接種以1.5×106個/mL，加入SFM完全培養基至5 mL。培養48 h后，將培養上清吸至同一離心管內，1 500 r/min離心10 min。離心后的上清收集于新的離心管內，-20℃凍存備用。

HUVEC以2×104個/mL的密度接種于96孔板內，每孔接種100 μL，共接種3個培養板，用SFM完全培養基培養。培養24 h后，吸棄孔中培養基。每塊培養板分7組，每組6個復孔。正常對照組加入100 μL/孔的SFM完全培養基；條件對照組加入100 μL/孔的條件培養基(將上述收集的胃腺癌細胞培養上清與SFM完全培養基按1∶1的比例混勻)；川芎嗪組將含川芎嗪終濃度為25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的條件培養基依次加入相應各孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況。

1.3 統計學分析 上述實驗各進行2次，實驗數據用SPSS 13.0統計軟件進行處理,相同時間點均數間兩兩比較使用單因素方差分析，方差齊則用LSD-t檢驗，方差不齊用Dunnett’s-C檢驗。

2 結果

2.1 對胃腺癌細胞的影響 經不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表1。各川芎嗪組A值與相同時間的正常對照組相比較(P>0.05)。

表1 不同濃度川芎嗪對胃腺癌細胞增殖的影響

2.2 對HUVEC增殖的影響 經不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表2。各川芎嗪組A值與相同時間的正常對照組相比較(P>0.05)。

表2 不同濃度川芎嗪對正常培養條件HUVEC增殖的影響

2.3 對條件培養基誘導HUVEC增殖的影響 經不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表3；各川芎嗪濃度組抑制率見表4。各組光吸收值均隨培養時間的延長而升高；條件對照組和各川芎嗪組A值高于相同時間的正常對照組，差異有顯著性(P<0.05)；川芎嗪濃度為125 μg/mL(川芎嗪4組)作用48、72 h、濃度為625 μg/mL(川芎嗪5組)作用24、48、72 h對SGC-7901胃癌細胞條件培養基誘導的HUVEC增殖有明顯影響(P<0.05)，川芎嗪濃度為125～625 μg/mL時，增殖抑制率隨著作用時間的延長而升高(見表4)。

表3 不同濃度川芎嗪對條件培養基誘導的HUVEC的增殖的影響

表4 不同濃度川芎嗪對條件培養基誘導HUVEC增殖的抑制

3 討論

川芎嗪在臨床主要應用于缺血性心、腦血管疾病，同時能通過直接抑制腫瘤、化療增效與減毒作用、調節免疫機制等作用達到抗腫瘤效應；能通過下調腫瘤多藥耐藥基因蛋白(P-gp)而克服腫瘤細胞耐藥性;通過影響腫瘤細胞黏附與侵襲、抗凝血與抗血小板集聚作用而發揮抗腫瘤轉移作用[5]。研究者還發現，川芎嗪可有效抑制大鼠胃癌前病變組織和小鼠Lewis肺癌組織中微血管增生[3,6]，從而減少腫瘤的增殖和轉移。 本研究顯示，川芎嗪對SGC-7901細胞和HUVEC無直接殺傷作用，但對胃癌細胞條件培養基誘導HUVEC的增殖具有抑制作用。反映川芎嗪可通過抑制腫瘤血管生成而發揮預防和治療作用。腫瘤細胞能分泌各種促血管生成因子，這些因子與其相應的受體相結合，是促使腫瘤新生血管增殖、遷移和形成管腔的重要原因[7-8]，故川芎嗪對胃癌細胞條件培養基誘導的HUVEC增殖的抑制作用，可能與影響胃腺癌細胞條件培養基中促血管生長因子與其受體結合的中間環節有關。研究表明[9-10]，川芎嗪抑制腫瘤新生血管生成的作用可能與抑制血管內皮細胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的表達有關，但川芎嗪對這兩種因子影響的具體作用機制目前不甚明了，是否對其它因子或受體具有抑制作用也尚未清楚，因此要明確川芎嗪抑制腫瘤新生血管生成的具體機制和作用環節仍需進一步研究。

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