檢測豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體的兩種ELISA方法的比較及其應(yīng)用

吳雪軍，周彩琴，趙靈燕，陳星宇，吳赟竑，王燕萍，張傳亮，姜中其，徐 輝

（1.浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州310020；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310029）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS），是一種由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起的、以母豬繁殖障礙及仔豬和育肥豬呼吸道疾病為特征的急性病毒性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均能感染，臨床主要特征為流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困難。PRRS在全世界各主要養(yǎng)豬國家均有發(fā)生，近年來我國也有多個(gè)省份的養(yǎng)豬場、農(nóng)戶暴發(fā)疫情，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有操作簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化、快速敏感等優(yōu)點(diǎn)，非常適合進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測［3］。目前，針對(duì)PRRSV的不同抗原有兩種檢測PRRSV抗體的ELISA方法：G－ELISA方法采用膜蛋白（M 蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作為包被抗原；N－ELISA方法以核衣殼蛋白（N蛋白）作為主要包被抗原。本試驗(yàn)擬通過對(duì)這兩種間接ELISA方法進(jìn)行比較，分析其在免疫監(jiān)測和臨床檢測中的特點(diǎn)，為應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 N蛋白抗體檢測ELISA（N－ELISA）試劑盒由美國IDEXX公司生產(chǎn)（Herd－Check＊PRRS X3），批號(hào)：40959－V931；膜蛋白抗體ELISA（G－ELISA）試劑盒由法國LSI公司生產(chǎn)（LSI TEST SUIS PRRS），批號(hào)：5－VETPRA－004。

1.2 檢測樣品 根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)從浙江省內(nèi)的10個(gè)規(guī)模豬場采集豬血清共216份，其中仔豬70份，生長豬30份，后備種豬40份，育肥豬76份，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測方法及結(jié)果判定 PRRSV抗體檢測方法均按照試劑盒說明書進(jìn)行。N－ELISA方法以（S／N）值判定結(jié)果，其中S／N≥0.40為PRRS抗體陽性，S／N＜0.40為PRRS抗體陰性；G－ELISA 方法以IRPC值判定結(jié)果，其中IRPC≤20.0為抗體陰性，IRPC＞20.0為抗體陽性。為方便兩種ELISA方法檢測結(jié)果比較分析，將IRPC值標(biāo)準(zhǔn)化，即將IRPC轉(zhuǎn)換成IRPC／100，與S／P值一致。

1.4 檢測數(shù)據(jù)處理分析 通過計(jì)算相關(guān)系數(shù)、符合率、Kappa值等統(tǒng)計(jì)學(xué)和流行病學(xué)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種檢測方法結(jié)果一致性的分析 采用兩種檢測方法同時(shí)檢測10個(gè)豬群216份血清，并按試劑盒給定的臨界點(diǎn)來判斷結(jié)果的陰陽性，具體結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，兩種ELISA方法在檢測PRRS血清抗體時(shí)，陽性率差異不顯著（P＞0.05），符合率達(dá)到92.6%，Kappa值為0.74，表明兩種ELISA檢測方法在按試劑盒提供的陰陽性臨界點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果定性判斷并統(tǒng)計(jì)抗體陽性率時(shí)，具有良好的一致性（表1、圖1）。但是，兩種檢測方法所得到的PRRS抗體水平效價(jià)差異明顯，相關(guān)系數(shù)也僅為0.651，見圖2。

2.2 設(shè)定不同陰陽性臨界點(diǎn)時(shí)兩種檢測方法的陽性率變化 以全部216份豬血清樣品作為一個(gè)整體，將G－ELISA方法所得結(jié)果IRPC值轉(zhuǎn)換成IRPC／100后，通過調(diào)整兩種ELISA方法的陰陽性臨界點(diǎn)比較檢測相同樣品時(shí)的豬群PRRS抗體陽性率的變化趨勢(shì)，如圖3結(jié)果所示，兩種檢測方法在同時(shí)調(diào)整陰陽性臨界點(diǎn)時(shí)，總體變化趨勢(shì)基本一致，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立的方程分別為：y＝－1.504 9x＋86.694和y＝－4.210 3x＋84.26，斜率為－1.504 9和－4.210 3，G－ELISA方法的陽性率變化幅度更大，統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈顯著差異。

為進(jìn)一步分析陰陽性臨界點(diǎn)變化對(duì)兩種ELISA方法陽性率檢測結(jié)果的影響，以A、B、C、D四個(gè)豬群作為研究對(duì)象，調(diào)整陰陽性判定的臨界點(diǎn)，分析在不同免疫狀況下，兩種檢測方法所得出的陽性率變化情況，具體結(jié)果見圖4、5。

由圖4、圖5可知，當(dāng)臨界點(diǎn)逐漸提高以后，用兩種檢測方法所得的陽性率逐漸降低，且對(duì)不同的免疫背景豬群陽性率變化總體趨勢(shì)均沒有顯著的影響。但兩者的下降幅度有所不同，N－ELISA檢測方法對(duì)PRRS弱毒苗免疫后30d豬群陽性率明顯高于G－ELISA；而PRRS弱毒苗免疫后107d豬群陽性率檢測結(jié)果表明，G－ELISA的高抗體水平維持時(shí)間比N－ELISA長。

3 分析與討論

一直以來，國內(nèi)通常以N－ELISA（美國IDEXX公司生產(chǎn)）作為PRRSV抗體檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該方法敏感、特異、快速，適合于PRRS的早期預(yù)警。但由于N蛋白不能誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體，應(yīng)用中常被認(rèn)為以N蛋白作為包被抗原的試劑無法反應(yīng)機(jī)體的免疫狀態(tài)，不適合用于對(duì)疫苗免疫效果監(jiān)測。G－ELISA以膜蛋白（包括 M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）。其中 GP5蛋白是一種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)于受體識(shí)別具有一定的作用。由于N端的外側(cè)結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)主要的中和抗體決定簇，這就證實(shí)了GP5結(jié)構(gòu)在病毒的侵染過程中起著一定的作用［1～3］。由于膜蛋白為PRRSV主要表面抗原，在病毒傳播和機(jī)體免疫中起關(guān)鍵作用，因此普遍認(rèn)為采用膜蛋白作為包被抗原的ELISA診斷方法不僅能檢測野毒感染狀況，而且能解決N蛋白作為抗原的診斷方法無法反映機(jī)體免疫狀況的缺陷，有利于疫苗抗體水平的檢測，為豬場進(jìn)行疫苗免疫效果評(píng)估提供重要的技術(shù)手段，所以這種方法在評(píng)估疫苗的免疫效果中更為準(zhǔn)確可靠。

研究結(jié)果表明，G－ELISA與N－ELISA兩種檢測方法陽性率結(jié)果差異并不顯著，具有很高的符合率和一致性。因此，通過數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，調(diào)整陰陽性判定的臨界點(diǎn)，兩種方法在一定程度上互相代替是可行的。由于兩種方法包被的抗原不同，N－ELISA方法測出的陽性率和效價(jià)均比G－ELISA要高，這也與N蛋白在病毒粒子中表達(dá)量較高相吻合，同時(shí)這也可能造成了一定比例的假陽性。當(dāng)采用N－ELISA方法做免疫效果評(píng)估時(shí)，若發(fā)現(xiàn)與免疫保護(hù)效果相關(guān)性差距較大時(shí)，應(yīng)考慮選用G－ELISA方法，并適當(dāng)調(diào)整陰陽性判定的臨界點(diǎn)，使得與實(shí)際情況更符合。

在對(duì)陰性豬場進(jìn)行PRRSV抗體監(jiān)測時(shí)，可考慮采用N－ELISA方法，以便能夠較早的發(fā)現(xiàn)病毒感染，為防疫爭取更多的時(shí)間；臨床穩(wěn)定且用PRRS疫苗免疫的豬場建議采用N－ELISA方法，并可以通過調(diào)整陰陽性臨界點(diǎn)，使結(jié)果更接近G－ELISA和豬群的實(shí)際情況；對(duì)于臨床不穩(wěn)定的豬場，應(yīng)當(dāng)采用G－ELISA方法進(jìn)行抗體檢測，以準(zhǔn)確反應(yīng)豬群的整體免疫狀況，但建議對(duì)現(xiàn)有的陰陽性臨界點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整，因?yàn)楦鶕?jù)現(xiàn)有商品化試劑盒提供的N－ELISA和G－ELISA判定依據(jù)獲得的群體抗體陽性率并未表現(xiàn)出顯著差異，也無法以更好的體現(xiàn)出G－ELISA方法的特點(diǎn)。

［1］杜文金，劉衛(wèi)，王志亮，等.應(yīng)用重組豬生殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白為抗原建立ELISA檢測方法的研究［J］.中國獸醫(yī)科技，2000，30（6）：7－9.

［2］Ferrin N H，F(xiàn)ang Y，Johnson C R，etal.Validation of a blocking enzyme－linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2004，11：503－514.

［3］Seuberlich T，Tratschin J D，Thur B，etal.Nucleocapsid proteinbased enzyme－linked immunosorbent assay for detection and differentiation of antibodies against European and North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2002，9：1183－1191.