局部應用L-精氨酸對糖尿病小鼠創面愈合的影響

陳曉華 于攀 李世榮 王珍祥

局部應用L-精氨酸對糖尿病小鼠創面愈合的影響

陳曉華 于攀 李世榮 王珍祥

目的研究局部應用L-精氨酸對糖尿病小鼠創面治療效果的影響。方法建立鏈脲霉素（Streptozotocin，STZ）誘導的Ⅰ型糖尿病小鼠創面模型；昆明小鼠隨機分為正常對照組（A組）、糖尿病對照組（B組）、糖尿病精氨酸治療組（C組），糖尿病小鼠創面模型建立后,觀察及測量傷后0、4、8、14、16 d時創面愈合面積、肉芽生長情況、組織形態學改變、羥脯氨酸（OHP）含量。結果C組創面愈合明顯加快（P＜0.05），創面成纖維細胞數量、膠原生成增多，OHP含量增加。結論局部應用L-精氨酸，通過加快肉芽生成，增加創面成纖維細胞數量，能促進糖尿病創面愈合。

糖尿病L-精氨酸創面愈合一氧化氮

糖尿病創面具有愈合明顯延遲的現象，在其分子機制中一氧化氮（Nitric Oxide，NO）占了很重要的地位[1]。L-精氨酸是NO合成的唯一底物，口服精氨酸可改善傷口愈合，增加創傷部位膠原含量和組織抗張強度[2]，但其局部應用對于糖尿病創面愈合的影響報道較少。本研究擬通過對糖尿病小鼠創面局部應用精氨酸，探討其可否促進糖尿病創面的修復及機制，為其臨床應用提供客觀的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

SPF昆明小鼠75只，體重（27±2）g（第三軍醫大學實驗動物中心）。L-精氨酸（上海生工生物工程技術服務有限公司），STZ（Sigma公司），戊巴比妥鈉（Merk公司），OHP含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 糖尿病創傷模型的建立[3-4]

將小鼠連續5 d腹腔注射STZ（45 mg/kg），第5次注射后，小鼠禁食不禁水10 h，由小鼠尾靜脈取血，快速血糖儀測量空腹血糖水平。空腹血糖濃度高于11.1 mmol/L，且連續出現多飲、多食、多尿者選為糖尿病模型小鼠。如血糖濃度低于11.1 mmol/L，以同樣濃度STZ注射3 d繼續誘導，使其血糖濃度高于11.1 mmol/L。模型建立后4周，小鼠背部10%硫化鈉脫毛，溫水清洗，拭干。次日，以戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用組織剪在小鼠背部剪去直徑約1 cm的圓形皮膚組織。

1.3 實驗分組及給藥[5]

將L-精氨酸溶解于去離子水中，制成濃度為100 g/L的溶液。動物分為3組：正常對照組（A組）、糖尿病對照組（B組）和糖尿病精氨酸治療組（C組），每組25只小鼠。每天在C組小鼠創面噴灑注射L-精氨酸溶液0.15 mL，A組和B組創面使用同量的去離子水。

1.4 計算創面愈合率

于傷后0、4、8、14、16 d時測量創面面積，計算創面愈合率。測量方法是用透明方格紙描繪創口，掃描入電腦后，以Adobe Photoshop CS2測量創面面積。

1.5 標本取材及處理

每組動物分別于傷后第4、8、14天切取愈合創面組織，固定于4%多聚甲醛中，常規石蠟包埋切片，沿凸起最高點縱行切片，切片厚5 μm，行常規HE染色。

1.6 創面組織中OHP含量測定

創面組織準確稱重后，加9倍等滲鹽水制成10%的勻漿，離心，將上清稀釋成2%的濃度，按OHP含量測定試劑盒說明進行測定。

1.7 統計學處理

計量資料數據以（均數±標準差）表示，用SPSS 12.0統計軟件進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病小鼠創面模型的建立

STZ（45 mg/kg）注射后第4周，小鼠空腹血糖濃度為（20.62±1.23）mmol/L，沒有動物死亡，且連續出現多食、多飲、多尿癥狀。對各組小鼠實施創面形成術后，動物無死亡。

2.2 形態學觀察

實驗A、C組肉芽組織生成好，炎癥反應輕，創面上皮化時間早，到創傷后第14天基本完全愈合，且皮膚張力強度同正常皮膚；實驗B組肉芽組織色暗、水腫，生長不良，炎癥反應較重，創面愈合延遲，且皮膚張力較低（圖1）。

2.3 組織學觀察

光鏡下可見創傷后A組和C組成纖維細胞數量較多，血管增生及膠原形成活躍。至創傷后第14天，成熟成纖維細胞增多，細胞排列成束狀，炎癥細胞很少。B組愈合過程中有較多炎性細胞，新生毛細血管、成纖維細胞及膠原生成較另兩組少，創傷后第14天成纖維細胞排列紊亂，炎性細胞較另兩組多（圖2）。

圖1 創傷后第8天各組創面情況

圖2 創傷后第8天各組HE染色（400×）

2.4 創面愈合率

B組比A組愈合明顯延遲；C組與B組相比，在傷后第4天創面愈合率顯著增加（P＜0.05）（表1）。

表1 各組創面愈合率的比較(%，X±S，n=8)

2.5OHP含量

3組創面羥脯氨酸水平在創面形成后即明顯下降，之后逐漸增高。創面形成后第4天起各時相點A、C組的羥脯氨酸水平均顯著高于B組（表2）。

表2 各組羥脯氨酸含量比較(mg/g，X±S，n=3)

3 討論

L-精氨酸是體內蛋白氮重要的載體、一種條件必需氨基酸，其可經一氧化氮合酶(NOS)、精氨酸酶生成一氧化氮（NO）、脯氨酸等活性分子，對創面愈合過程發揮重要的調節作用[6]。NO可參與并促進皮膚組織創傷恢復的整個過程[7]，其作用表現在誘導成纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞和角質細胞的增殖與分化、增進血管生成、參與基質的沉積和重塑、調節創傷愈合炎癥反應中多種細胞因子的活性等。有研究表明在創傷后糖尿病小鼠皮膚組織中NO生成明顯減少[8]。本研究采用局部應用L-精氨酸的方法觀察其對糖尿病小鼠創面愈合的影響，結果表明：精氨酸對糖尿病創面具有明顯的促愈作用。實驗C組創面愈合率明顯高于B組，創傷后創面快速收縮，肉芽組織形成良好；在愈合晚期，創面愈合時間提前2～3 d，并呈現更好的皮膚愈合及毛發生長。

在局部應用L-精氨酸后，實驗C組成纖維細胞增殖較快，膠原纖維排列較整齊，炎癥反應發生較B組發生早。糖尿病創面炎癥反應的延遲和失調是其難愈的主要原因之一[9]。局部應用L-精氨酸可使創面中延遲出現的炎癥反應得到改善，表明其經一氧化氮合成酶(NOS)途徑產生NO，可影響創面早期的炎癥反應等。

羥脯氨酸是膠原蛋白的重要組成部分，對膠原合成、細胞外基質產生、創面修復和組織重塑至關重要，其含量可以反映創傷愈合的狀況。創傷后第4天開始C組明顯高于B組，表明局部應用L-精氨酸可促進膠原合成，從而加快創面愈合。

本研究通過簡單的方法建立了穩定的糖尿病小鼠創面模型，證實了局部應用L-精氨酸可通過促進成纖維細胞增殖、膠原合成及改善創面炎性反應延遲，明顯促進糖尿病創面的愈合。

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[9]Pierce GF.Inflammation in nonhealing diabetic wounds:the spacetime continuum does matter[J].Am J Pathol,2001,159(2):399-403.

Effect of L-arginine on the Wound Healing of Diabetic Mice

CHEN Xiaohua1,YU Pan2,LI Shirong2,WANG Zhenxiang2.
1 Shanghai Time Plastic Surgery Hospital,Shanghai 200021,China;2 Department of Plastic Surgery,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China.

ObjectiveTo investigate the effect of L-arginine used in the wound of mice with diabetes.MethodsType I DM mice induced by streptozotocin were used as the animal model.Seventy five male KM mice were used in this study and were randomly divided into group A(normal control,n=25),group B(diabetic control,n=25)and group C(diabetes with L-arginine administration,n=25).The percentage of healing areas,the granulation tissue formation,the histological and morphological changes and the content of hydroxyproline were observed and measured on the 0,4,8,14,and 16 days after injury.ResultsThe treatment group C showed better wound healing than the group B.The contents of fibroblasts,collagen and OHP increased,compared with those in the group B(P＜0.05).ConclusionThe local application of L-arginine could promote the healing of wounds in diabetic mice by stepping up the granulation tissue formation and increasing fibroblasts quantity in trauma.

Diabetes;L-arginine;Wound healing;Nitric Oxide

R619+.6

A

1673-0364（2009）04-0205-03

2009年3月29日；

2009年5月9日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.007

200021上海市上海時光整形外科醫院（陳曉華）；400038重慶市第三軍醫大學西南醫院整形外科（于攀，李世榮，王珍祥）。