SFRP 2與Periostin的相互作用在瘢痕疙瘩形成機制中的研究

王珍祥 袁順宗 陶熹 李世榮 吳軍

SFRP 2與Periostin的相互作用在瘢痕疙瘩形成機制中的研究

王珍祥 袁順宗 陶熹 李世榮 吳軍

目的利用pull-down技術驗證凋亡相關蛋白基因SFRP 2（Secreted frizzled-related protein 2）和骨母細胞特異性因子-2 Periostin（Osteoblast-specific factor 2）間的相互作用。方法構建能在哺乳動物細胞中表達帶HA標簽的Periostin融合蛋白（HA-Periostin）的重組載體pCMV-HA-Periostin，經酶切鑒定正確后，和表達帶Myc標簽的融合蛋白（Myc-SFRP 2）的重組真核表達載體pCMV-HA-SFRP2，單獨或共轉染人293細胞，利用pull-down技術驗證Periostin與SFRP 2間的相互作用。結果成功構建重組載體pCMV-HA-Periostin，與抗Myc單克隆抗體沉淀Myc-SFRP 2相互作用蛋白復合物后，可以檢測到HA-Periostin的表達。通過體外蛋白質結合實驗證實了Periostin與SFRP 2間的相互作用。結論成功構建帶HA標簽的Periostin融合蛋白（HA-Periostin）的重組載體，利用pull-down技術證實了Periostin與SFRP 2間的存在相互作用。

凋亡相關蛋白基因骨母細胞特異性因子-2相互作用

瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡功能抑制的相關信號途徑研究，尚缺少文獻報道[1]。本課題組對同體瘢痕疙瘩和正常皮膚內差異表達的基因進行了基因芯片篩選，確定了顯著高表達基因SFRP 2（Secreted frizzled-related protein 2)[2]。進一步在原代培養的瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常成纖維細胞中，利用RTPCR技術從基因水平上證實SFRP 2基因在前者中的表達要顯著高于后者。SFRP 2蛋白可能是調控瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的新的重要信號分子。但是，SFRP 2如何在成纖維細胞中發揮其抑制凋亡功能尚不清楚。我們利用酵母雙雜交技術對SFRP 2的相互作用蛋白進行初步篩選，獲得了一個能間的相互作用。分別構建了SFRP 2的融合蛋白Myc-SFRP 2和Periostin的融合蛋白HA-Periostin的表達載體pCMV-HA-SFRP 2和pCMV-HA-Periostin，驗證構建成功后，利用免疫共沉淀驗證SFRP 2與Periostin間是否存在相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、含SFRP 2基因序列的重組載體pCMV-Myc-SFRP 2和含Periostin編碼序列的重組載體pACT2-Periostin均為本課題組保存。pCMVHA載體、Myc單抗和HA多抗購自美國Clontech公司，HRP標記的羊抗兔IgG及化學發光液購自武漢博士德公司，細胞裂解液RIPA購自美國Santa Cruz公司，蛋白標準品及其檢測抗體購自日本TaKaRa公司，質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Omega公司；DNA、蛋白質相對分子量標準購自北京鼎國生物技術公司；Anti2Syntro2phin單抗、ECL Western印跡檢測試劑盒購自美國Chemicon公司。1.2方法

1.2.1 重組載體pCMV-HA-Periostin的構建

分別根據pACT2-Periostin和空載體pCMVHA的特點，進行Sfi I和Xho I雙酶切；0.6%瓊脂糖凝膠電泳酶切產物后，切割含目的片段和載體的凝膠，回收；T4 DNA連接酶轉化，質粒擴增，用Sfi I和Xho I雙酶切鑒定，并凝膠電泳酶切。

1.2.2 融合蛋白的誘導表達

1.2.2.1 GST-SFRP2融合蛋白在宿主菌中的誘導表達及純化

將測序正確的重組表達載體轉化到宿主菌中，按常規實驗方法[12]得到純化的融合蛋白瓊脂糖株，-20℃保存備用。

1.2.2.2 His-Periostin融合蛋白在宿主菌中的誘導表達

將保存的重組表達載體pACT2-Periostin轉化到宿主菌中，按常規實驗方法[12]收集上清，即為含有His-Periostin融合蛋白的細菌裂解液，每管1 mL分裝待用或-80℃保存。

1.2.3 瘢痕疙瘩組織裂解液的制備

取瘢痕疙瘩組織，用冰冷的PBS洗凈，每克組織中加入10 mL裂解液，然后用勻漿器冰浴、離心，取上清即為瘢痕疙瘩組織裂解液。

1.2.4 GST pull-down

將等量純化的GST和GST-SFRP 2分別加入1 mL瘢痕疙瘩組織裂解液中，4℃持續混和3 h。按常規方法處理，收集沉淀，即為GST pull-down沉淀復合物。

1.2.5 Western印跡

參照文獻[3]的方法，電泳，蛋白轉移，加入抗His標簽的抗體，洗膜二抗孵育，參照ECL化學發光試劑盒說明書于暗室內發光曝光。

2 結果

2.1 重組載體pCMV-Myc-SFRP 2和pCMV-HAPeriostin的鑒定

經酶切、電泳后獲得的圖譜顯示(圖1)，近800 bp處的條帶為酶切后的目的片段SFRP 1編碼基因（圖1，條帶3），近2 500 bp處的條帶為酶切后的目的基因Periostin(圖2，條帶2)，表明pCMV-Myc-SFRP 2和pCMV-HA-Periostin分別構建成功。實驗重復3次，結果均一致。

圖1 pCMV-Myc-SFRP 2重組載體酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 pCMV-HA-Periostin重組載體酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 利用pull-down再次證實SFRP 2和Periostin間存在相互作用

經pull-down實驗顯示，在單獨加入GST-SFRP 2融合蛋白或His-Periostin融合蛋白的細菌裂解液到瘢痕疙瘩組織裂解液中時，僅僅顯示自身1個條帶，沒有相互作用，而一旦同時加入GST-SFRP 2融合蛋白和His-Periostin融合蛋白的細菌裂解液到瘢痕疙瘩組織裂解液中，不管是His pull-down還是GST pull-down，都檢測出GST-SFRP 2和His-Periostin兩個條帶，說明它們存在相互作用（圖3）。

圖3 分別利用His pull-down和GST pull-down技術證實SFRP 2和Periostin間存在相互作用

3 討論

凋亡在創傷愈合中具有重要作用，隨著細胞外基質的產生和降解，細胞的增殖和凋亡保持平衡。而瘢痕疙瘩中成纖維細胞的凋亡和增殖發生改變，大量研究表明KFs的凋亡率要低于NFs，其中已證實p53、p63和p73參與了病理性瘢痕的發展，尤其是p53在瘢痕疙瘩中的表達要遠高于在正常和增生性瘢痕中的表達，且p53的突變能夠引起KFs的凋亡[4]。因此，創傷愈合過程中成纖維細胞的活化、增殖、凋亡抑制，以及其分泌的膠原引起細胞外基質的大量沉積，是引起瘢痕疙瘩的主要病理機制。目前已證實的TGF-β、PDGF、CTGF和p53等分子的功能可部分揭示瘢痕疙瘩的發病機制，同時也有研究表明瘢痕疙瘩中還存在著其他更多的分子信號機制[5-6]。

SFRP 2位于4q31.3，其全長約2 kb，表達于胞漿，也可分泌至胞外，其主要功能為抑制細胞凋亡。SFRP 2通過調控Wnt信號發揮其調節細胞抗凋亡的作用[7]。在進一步對纖維化相關的基因芯片篩選和差異蛋白表達的文獻分析的基礎上，我們認為SFRP 2在瘢痕疙瘩中可能具有更重要的功能，其原因在于：①另一研究小組利用基因芯片技術篩選了同體瘢痕疙瘩和正常皮膚的差異表達基因，結果表明在所篩選出與凋亡相關的基因中，SFRP 2基因在瘢痕疙瘩中也呈顯著高表達[8]；②從瘢痕疙瘩分離的成纖維細胞在體外培養經氫化可的松處理前后，表達變化同樣存在著明顯差異。

Periostin，即骨母細胞特異性因子2（Osteoblastspecific factor 2，OSF-2），位于人染色體13q13.3，全長約3 kb，編碼一個大小為90 kD左右的可溶性胞漿蛋白質。該蛋白可分泌至細胞外基質中發揮作用。既往研究表明，Periostin能夠促進Ⅰ型膠原的生成，在以瘢痕疙瘩為代表的纖維化疾病中可能具有非常關鍵的功能，其主要原因在于：①瘢痕疙瘩與正常皮膚組織的基因芯片篩選結果顯示，Periostin在瘢痕疙瘩中高表達[10-11]；②在蛋白水平上，與正常組織相比，瘢痕疙瘩組織中Periostin在蛋白水平上的表達同樣表現為增高；③Periostin基因敲除后會導致心肌創傷愈合時成纖維細胞數量減少、膠原原纖維形成受損，引起心肌纖維化修復失敗，并且Periostin可通過PI3K、MAPK和整合素等下游分子調控心肌細胞的增殖；④Periostin與Ⅰ型膠原蛋白間存在相互作用，調控真皮結締組織中膠原原纖維的形成。故Periostin在瘢痕疙瘩組織中表達增高，是瘢痕相關基因；Periostin蛋白在瘢痕疙瘩形成中可能發揮重要作用[9]。

本實驗分別成功構建了SFRP 2的融合蛋白Myc-SFRP 2和Periostin的融合蛋白HA-Periostin的表達載體pCMV-HA-SFRP 2和pCMV-HAPeriostin。近800 bp處的條帶為酶切后的目的片段SARP 1編碼基因，近2 500 bp處的條帶為酶切后的目的基因Periostin。隨后，利用His pull-down及GST pull-down驗證一旦同時加入GST-SFRP 2融合蛋白和His-Periostin融合蛋白的細菌裂解液到瘢痕疙瘩組織裂解液中，不管是His pull-down還是GST pull-down，都檢測出GST-SFRP 2和His-Periostin兩個條帶，說明Periostin和SFRP 2間存在相互作用。現有的文獻報道也表明Periostin和SFRP 2在瘢痕疙瘩、器官纖維化中的表達與正常組織相比，二者在基因水平上均同時表達增高[11]；SFRP 2的功能以抑制成纖維細胞凋亡為主，Periostin的功能以調控成纖維細胞的膠原生成占主導，這些功能便與瘢痕疙瘩形成的主要分子機制即成纖維細胞凋亡受抑和活化的成纖維細胞生成、分泌膠原過多相對應，提示SFRP 2和Periostin間的相互作用可能是瘢痕疙瘩形成中的重要分子機制。

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Experimental Study of Interaction between SERP 2 and Periostin in the Formation of Keloid

WANG Zhenxiang, YUAN Shunzong,TAO Xi,LI Shirong,WU Jun.Department of Plastic Surgery and Institute of Burn,Southwest Hospital, Affiliated Third Military Medical University,Chongqing 400038,China.Corresponding author:LI Shirong,WU Jun.

ObjectiveTo investigate the interaction between Periostin（osteoblast-specific factor 2）and SFRP 2(Secreted frizzled-related protein 2)in the formation of keloid.MethodsHA-tagged fusion protein(HA-Periostin)expression vector was constructed,identified and transfected into human embryo kidney 293(HEK293)cells alone or with Myc-tagged fusion protein(Myc-SFRP 2)expression vector pMCV-Myc-SFRP 2.The interaction between SFRP 2 and Periostin was detected by pull-down technique.ResultsDouble restriction enzyme digestion showed that pCMV-HA-Periostin was constructed successfully.When Myc-SFRP 2 was immunoprecipitanted,HA-Periostin was identified.And the interaction between SFRP 2 and Periostin was found by GST pull-down and His pull-down technique.ConclusionThe recombinant vector pCMV-HAPeriostin was constructed successfully.The interaction between SFRP 2 and Periostin could be identified by GST pull-down and His pull-down.

Secreted frizzled-related protein 2;Periostin;Interaction

R619+.6

A

1673－0364（2009）04－0199－04

2009年5月20日；

2009年7月19日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.005

國家重點基礎研究發展規劃項目（G1999054204）。

400038重慶市第三軍醫大學附屬西南醫院整形外科。

李世榮，吳軍。