利用人源化小鼠研究組織工程材料的體內免疫原性

張秋玉 盛慧明 崔磊 王瑛 尹爍 林錦驃 吳娟娟 沈佰華 王利 李寧麗

利用人源化小鼠研究組織工程材料的體內免疫原性

張秋玉 盛慧明 崔磊 王瑛 尹爍 林錦驃 吳娟娟 沈佰華 王利 李寧麗

目的建立并利用人源化小鼠模型，研究組織工程材料的體內免疫原性。方法利用NOD/SCID小鼠（非肥胖型糖尿病鼠與重癥聯合免疫缺陷鼠反交鼠模型），通過腹腔注射人外周血單個核細胞（PBMC）（100×106）建立人源化小鼠，在人源化小鼠皮下植入異體人皮膚（陽性對照）、人體脂肪干細胞與脫鈣骨構建的組織工程骨（實驗組）、單純脫鈣骨材料（陰性對照）。在植入后1周、2周、3周、4周，取小鼠尾靜脈血，流式細胞儀檢測人CD4+和CD8+淋巴細胞比例。4周后，取小鼠的移植局部皮膚進行HE染色分析，同時檢測脾細胞人CD4+和CD8+淋巴細胞比例。結果NOD/SCID小鼠腹腔注射人PBMC 4周內，在外周血和脾中均可測到人CD4+和CD8+淋巴細胞。病理分析結果顯示：在人源化小鼠皮下植入的組織工程材料及成體干細胞構建的組織工程骨組未見炎性細胞浸潤；而單獨植入人皮膚組可見明顯的炎性細胞浸潤。結論人源化小鼠可作為組織工程材料體內免疫原性的研究的良好模型。

非肥胖型糖尿病鼠與重癥聯合免疫缺陷鼠反交鼠模型小鼠免疫原性組織工程材料

再生醫學與組織工程嘗試用干細胞構建修復缺損病變的組織與器官，需要充沛、穩定、安全的種子細胞來源。成體干細胞作為一種新的干細胞來源，具有弱免疫原性以及負性免疫調節作用的特性[1，2]。目前，關于人的異體干細胞免疫原性的體內研究報道較少，體內實驗對于判斷異體干細胞組織材料是否具有免疫原性極為重要。隨著NOD/SCID小鼠的培育成功，為建立人源化動物模型及在體研究異體干細胞免疫原性提供了可能[3-6]。脂肪源干細胞（Adiposederived stem cells，ADSCs）是來源于脂肪組織的一類具有自我更新和多向分化能力的成體干細胞[7]，與其他的成體干細胞一樣，ADSCs也具有免疫負調節功能[8-9]。關于人源化NOD/SCID小鼠用于研究干細胞及組織工程材料的體內免疫原性尚無報道。

本研究在建立了人源化NOD/SCID小鼠基礎上，用該模型進行體內（皮下）移植人皮膚、組織工程材料及覆蓋異體脂肪干細胞的組織工程材料，通過在接種后不同時間用流式細胞儀檢測受體小鼠的T細胞及其亞群格局及移植部位的淋巴細胞浸潤程度，分析該小鼠作為在體研究異體干細胞免疫原性模型和異體脂肪干細胞覆蓋的人工材料所具有的免疫原性，為進一步研究開發新型組織工程材料和異體脂肪干細胞用于臨床植入修復提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物、細胞

NOD/SCID小鼠，6周齡，雌性，購自中國軍事醫學科學院動物中心，飼養于上海交通大學醫學院實驗動物中心SPF實驗室獨立送風柜中；人外周血取自上海市血液中心；異體人皮片、異體干細胞覆蓋的硅膠及單純組織工程材料（硅膠）由上海市組織工程研究重點實驗室提供。

1.1.2 試劑和儀器

RPMI 1640培養液、血清及細胞培養液添加劑（Hyclone公司），96孔培養板（BD公司），FACS（BD Calibur公司），離心機（Sigma公司），淋巴細胞分離液Ficoll（密度1.077，上海試劑二廠），人APC-CD3、FITC-CD4、PE-CD8標記抗體（BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單個核細胞（PBMC）的分離

用生理鹽水將外周血按1∶2稀釋，小心疊加淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心20 min，用毛細滴管小心吸取上、中層界面處白色云霧狀的細胞層，用生理鹽水洗滌2次并計數。

1.2.2 人源化NOD/SCID小鼠的建立及鑒定

選擇6周齡、體型均一、毛色光亮的雌性NOD/ SCID小鼠，腹腔注射PBMC 100×106；分別于注射后1周、2周、3周、4周取尾靜脈血，通過紅細胞裂解液直接裂解紅細胞的方法分離白細胞，流式細胞儀檢測人CD4+、CD8+淋巴細胞百分率；4周后處死小鼠，分離脾細胞，檢測脾細胞中人CD4+、CD8+淋巴細胞百分率。

1.2.3 實驗分組與處理

在NOD/SCID小鼠腹腔注射PBMC次日，2%戊巴比妥麻醉模型鼠，無菌手術鈍性分離小鼠背部皮膚，分別對稱植入同種異體人皮膚（陽性對照），覆蓋異體脂肪干細胞[7-8]的脫鈣骨材料（實驗組），單純脫鈣骨材料（陰性對照）。小心縫合傷口。

1.2.4 取樣及檢測

在皮下接種后1周、2周、3周、4周后，分別取移植部位的皮膚，以4%多聚甲醛固定，常規HE染色分析；在每周取材的同時，流式細胞儀檢測人CD4+、CD8+、CD3+淋巴細胞百分率。最后一次取材時，處死人源化NOD/SCID小鼠，檢測小鼠脾細胞中人CD4+、CD8+淋巴細胞百分率。

1.3 統計學分析

本實驗數據采用SPSS軟件分析。兩樣本均數的比較采用t檢驗，P＜0.05有顯著性差異。

2 結果

2.1 NOD/SCID小鼠體液免疫和細胞免疫缺陷的驗證

為了保證人源重建鼠模型的成功構建，我們首先比較了野生型C57BL/6J小鼠（Wild type，WT）和NOD/SCID小鼠血清IgG水平以及脾細胞中CD4+及CD8+淋巴細胞的百分率。結果表明：NOD/SCID小鼠外周IgG（OD＝0.25）明顯低于野生型C57BL/6J小鼠血清IgG（OD＝1.00），兩者IgG水平有顯著性差異（P＝0.0036）（圖1A）。外周血T細胞及其亞群格局檢測結果顯示：C57BL/6J小鼠CD3+CD8+、CD3+CD4+所占比例分別為19.53%和42.09%，而NOD/SCID鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+所占比例分別為1.95%和0.81% (圖1B)。以上結果證明該鼠免疫系統是完全缺陷的。

2.2 人源化小鼠的體內人淋巴細胞的動態變化

在人源化小鼠建模1周、2周、3周、4周后，取外周血檢測其T細胞比例。結果表明：模型鼠外周血中人T細胞的含量隨著時間的推移而逐漸降低，4周后降至檢測下限（圖2A）。此外，在建模4周后，在脾細胞中仍能測到人CD4+及CD8+細胞（圖2B）。以上結果提示，腹腔注射的人PBMC，可進入NOD/ SCID小鼠的外周血和外周免疫器官，并能維持至少4周以上，提示人源小鼠模型構建成功。

2.3 人源化小鼠移接受移植物后體內人PBMC的動態變化

在人源化小鼠模型植入同種異體人皮片后，同上法觀察模型鼠的外周血人淋巴細胞比例。結果發現，模型鼠在接受移植物后，外周血中人T細胞比例較上述未接受移植物的空白模型組明顯降低，4周后幾乎無法測及。然而在脾細胞中，注射人PBMC 4周后，仍可測到少量的T細胞，所占比例較空白模型組有所降低，并有一定的個體差異（圖3）。結果提示，人PBMC細胞在接受移植物的人源化小鼠中，并非停留在外周血循環中，而主要通過循環到達移植部位發揮效應。

2.4 植入材料在不同時間點的淋巴細胞浸潤格局

在人源化小鼠皮下植入各種材料的1周及4周后，分別取出移植部位的皮膚進行HE染色分析其淋巴細胞浸潤程度。結果發現：人皮膚移植在移植后1周，于真皮下層組織即可見明顯的淋巴細胞浸潤，4周時更加明顯（圖4A）；而覆有干細胞的組織材料組不論在移植后的第1周還是第4周均未見淋巴細胞浸潤（圖4B），與陰性對照（單純硅膠材料移植組相似）（圖4C）。提示：異體來源組織確能激發NOD/SCID的人源化小鼠產生免疫應答，表現為移植物部位有大量淋巴細胞浸潤；而覆有干細胞的組織材料植入人源化小鼠后，未發現有淋巴細胞的浸潤，與單純硅膠材料移植組相似，提示異體干細胞并未在體內誘導免疫應答，與之前所報道的干細胞具有免疫負調節特性吻合[9]，同時也提示，該小鼠模型具有檢測干細胞材料的免疫原性應用潛能。

圖1 NOD/SCID小鼠體液及細胞免疫水平檢測

圖2 人源化小鼠外周血及脾細胞中人CD4+及CD8+細胞比例

圖3 接受移植物的人源化小鼠外周血及脾細胞中人CD4+及CD8+細胞的百分率

圖4 人源化NOD/SCID小鼠植入各種材料后的淋巴細胞浸潤情況

3 討論

免疫原性是限制異體移植和種子庫的關鍵，利用構建的人源化小鼠可以在體內觀察研究移植物包括目前干細胞構建的組織工程材料的免疫原性的動態變化過程。SCID(Severe Combined Immune-Deficiency)小鼠是首先由Bosma等人在C.B-17小鼠發現，因其B細胞與T細胞嚴重的免疫缺陷，無法排斥移植的人淋巴細胞，為人源化小鼠的構建提供可能。但SCID小鼠在生長發育過程中存在滲漏現象，即其免疫系統的功能可部分恢復。利用和NOD（Non obesity diabetes）鼠反交的方式獲得的NOD/SCID小鼠可減少滲漏現象[10-13]，它相對于僅T細胞功能缺陷裸鼠而言具有更加完整的免疫缺陷。因此我們選用NOD/SCID小鼠作為構建人源化小鼠模型的受體鼠，通過比較其與野生型C57BL/6J小鼠血清IgG水平及外周血淋巴細胞比例，提示NOD/ SCID小鼠細胞及體液免疫均處于缺陷狀態，無明顯滲漏現象。

構建人源化小鼠的方法較多，其中人外周血單個核細胞移植方法簡單易行，本研究采用該方法建立人源化小鼠。人源化小鼠體內人淋巴細胞的存活時間以及是否能有效發揮免疫應答功能是免疫重建的關鍵。已有文獻報道，人PBMC在重建人源化小鼠外周血中存在8周左右[14]。本研究的結果提示，在單純建模的人源化小鼠體內，人的PBMC可存在4周左右，可能是因為人PBMC接種數量以及個體差異所致[5]。本研究也發現，隨著時間的延長，模型鼠體內人PBMC的數量不斷減少，其中以外周血衰減尤為明顯。在建模4周后脾細胞中仍能測及人PBMC，這一現象提示腹腔注射的人PBMC可以遷移至外周血并在次級淋巴器官如脾等部位定居，為識別外來抗原和激發免疫應答提供可能。

在成功構建人源化NOD/SCID小鼠后，我們通過皮下種植各種組織材料，觀察其體內的免疫原性。研究結果首先發現，在人源化小鼠模型植入人皮膚后，其外周血中人淋巴細胞比例的減少速度較未接受移植物的模型組更快，且脾中人淋巴細胞比例也明顯降低。該結果提示：植入的人異體皮片能誘導人源化小鼠產生有效的免疫應答，通過動員外周血中的淋巴細胞，使之趨化到局部并參與免疫反應，從而表現為外周血及外周淋巴器官中人PBMC數量的快速衰減。同時，我們通過HE染色分析了不同材料移植組小鼠的皮膚切片，結果表明：陽性對照組的皮膚真皮組織中有大量淋巴細胞浸潤，而實驗組和陰性對照組未見炎性細胞浸潤。說明人源化小鼠體內的人淋巴細胞能夠有效識別異己抗原并行使免疫清除的功能，證實本研究建立的人源化小鼠可以模擬人體內的細胞免疫，觀察移植物的免疫原性。單獨硅膠移植組，因所采用的空材料支架免疫原性低下，人源鼠對其不識別，不激發免疫應答，未見淋巴細胞的浸潤。ADSCs與其他的成體干細胞一樣也具有免疫負調節功能[7-9]，而且脂肪干細胞來源容易、擴增量大，已經提示這是一種極有應用潛能的成體干細胞。本研究結果表明，人源化小鼠的人淋巴細胞不識別異體脂肪干細胞覆蓋的組織材料，說明異體脂肪干細胞作為種子細胞的組織工程材料仍然保持了成體干細胞的低免疫原性，極有可能成為潛在的組織工程種子細胞。

總之，本研究成功構建了人源化NOD/SCID小鼠模型，通過觀察模型鼠外周血人淋巴細胞比例的動態變化及移植局部的病理切片，表明該小鼠可作為在體研究異體干細胞免疫原性的動物模型。同時，本研究還提示：異體脂肪干細胞覆蓋的人工材料仍與無細胞的材料一樣具有低免疫原性，為進一步的臨床應用提高了實驗依據。

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Experimental Study of Immunogenicity of Tissue Engineering Materials by Using Humanized NOD/SCID Mice

ZHANG Qiuyu1,2,SHENG Huiming1,CUI Lei3,WANG Ying1,YING Shuo3,LIN Jinbiao1,WU Juanjuan1,SHEN Baihua1, WANG Li1,LI Ningli1.
1 Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Institute of Immunology,Shanghai 200025,China.2 Department of Immunology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China.3 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center,Shanghai 200235,China.Corresponding author:LI Ningli.

ObjectiveTo investigate the immunogenicity of new transplanted materials in vivo by using humanized NOD/SCID mice model.Methodshumanized mice model was established by transferred 100×106human peripheral blood mononuclear cells(PBMC)into NOD/SCID mice.Next day,the mice were received the allotransplantation of pieces of human skin from plastic surgery patients as positive control group and received tissue engineering materials(silica gel) accompanying with human adipose-derived stem cells(ADSCs)as experimental group.Negative control group was transplanted with silica gel alone.The percentage of human CD4+and CD8+T cells in peripheral blood and spleen was detected by fluo-rescent flow cytometry(FACS)at 1,2,3 and 4 weeks after operation.Human lymphocytes infiltration within the engrafted section was examined by hematoxylin-eosin staining 4 weeks after transplantation.ResultsHuman CD4+and CD8+T cells have been detected both in peripheral blood and spleen of humanized NOD/SCID mice.The percentage of human CD4+and CD8+T cells in peripheral blood decreased gradually.However,in the mice received the grafts,the percentage of human PBMC decreased much faster.The hematoxylin-eosin staining showed that in the experimental group, wound inflammatory response was slight,without lymphocytes infiltration.In contrast,all human skin grafts were rejected 4 weeks after subcutaneou transplantation.ConclusionThese results indicated that the humanized NOD/SCID mice model could be used to analyze the immunogenicity of new transplnted tissue material in vivo.

NOD/SCID mice;Immunogenicity;Tissue engineering material

R392.12

A

1673－0364（2009）04－0190－05

2009年4月16日；

2009年6月4日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.003

350004福建省福州市福建醫科大學免疫系（張秋玉）；200025上海市上海交通大學醫學院，上海市免疫學研究所（張秋玉，王瑛，盛慧明，林錦驃，吳娟娟，沈佰華，王利，李寧麗）；200235上海市上海組織工程研究與開發中心（崔磊，尹爍）。

李寧麗。