ＩＦＮ－γ對大鼠創(chuàng)面愈合中Ｓｍａｄ７表達(dá)的影響

李　璐　王繼華　趙亞南　李允怡

[摘要]目的：將干擾素γ（IFN-γ）應(yīng)用于大鼠創(chuàng)面，觀察創(chuàng)面肉芽組織的生長、成纖維細(xì)胞數(shù)目，分析IFN-γ對Smad7的影響。方法：選取成年SD大鼠127只，建立大鼠創(chuàng)傷模型。實(shí)驗(yàn)分成A、B、C、D、E共5組，每組25只。A組為生理鹽水溶劑對照組，B組為IFN-γ 500U /ml溶劑劑量組，C組為IFN-γ 1000U/ml溶劑劑量組，D組為2000U /ml溶劑劑量組，E組為空白組，正常對照組2只，為未損傷的正常大鼠。分別于創(chuàng)傷第3、7、10、14、21日隨機(jī)選取各組5只大鼠采用過量麻醉處死，剪取創(chuàng)面肉芽組織，分別行HE常規(guī)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察新生肉芽組織厚度、計數(shù)成纖維細(xì)胞數(shù)。行免疫組化染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肉芽組織中Smad7的表達(dá)情況。結(jié)果：各時間點(diǎn)A、B組肉芽組織厚度較C、D組致密且厚（P＜0.001），E組肉芽組織厚度介于A、B組和C、D組之間，（P＜0.05）；200倍光鏡下，目測計數(shù)成纖維細(xì)胞，傷后第3、21天，各組別成纖維細(xì)胞數(shù)量無差異（P＞0.05），傷后第7、10、14天，A、B組成纖維細(xì)胞數(shù)量比C、D、E組明顯增多（P＜0.001）；通過圖像分析檢測Smad7平均灰度和平均光密度。Smad7在傷后第3天、第14天表達(dá)較強(qiáng)，在C、D組中各時相的表達(dá)強(qiáng)于A、B、E組（P＜0.001），但C組和D組、A組和B組組間比較無差異（P＞0.05）。結(jié)論：干擾素γ（IFN-γ）可使新生肉芽組織生長緩慢、成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，延長創(chuàng)面愈合時間，并可使大鼠皮膚創(chuàng)面中Smad7表達(dá)增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞]大鼠；Smad7；干擾素γ（IFN-γ）；創(chuàng)面愈合

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）02-0201-04

Effects of interferon-γ on and Smad7 in wound healing of rats' skin

LI Lu1，WANG Ji-hua2，ZHAO Ya-nan2，LI Yun-yi3

（1. Department of Breast,the First People's Hospital of Kunming,Kunming 650011,Yunnan,Chnia; 2. Department o Plastic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650101,Yunnan,Chnia; 3.The Wu'Plastic Hospital of Kunming,Kunming 650000,Yunnan,Chnia）

Abstract:Objective To observe the effect of Smad7 in wound healing of rats' skin, and to investigate the growth of granulation tissue and fibroblast count. To analyze the mechanism of IFN-γ on signal transduction of Smad7.Methods Full thickness excisional wound on the back of rats were used as wound models. The rats were divided randomly into 5 groups as follows;①solvent control [saline solution (0.9% NaCl), group A]; ②IFN-γ500U/ml [group B]; ③IFN-γ1000U/ml[group C]; ④IFN-γ2000U/ml[group D]; ⑤blank control [group E]. And 2 rats were compared as normal control. Wound tissues were collected on the 3rd,7th,10th,14th and 21st postwounding days. All specimens were dealed with by the pathology tectology (HE) and immunohistochemistry staining technique (SP) to observe the growth of granulation tissue, fibroblast count, the expression level of Smad7.ResultsThe growth of granulation tissue and fibroblast count of groups C and D were less than groups A and B at the same day (P<0.001). But on the 3rd and 21st day after wound, there were no differences all the groups on fibroblast count (P>0.05). Image analysis showed that there were markable difference of Smad7 among the groups A,B and groups C,D (P<0.001), Group E was between them (P<0.05). The expression of Smad7 on 3rd and 14th days after wound was higher than other days (P<0.05).ConclusionIFN-γcan make growth of granulation tissue slow down and make fibroblast count reduce in wound healing of rats' skin. After administration, the expression of Smad7 is enhancing

Key words: rat; Smad7; IFN-γ; Wound healing

創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，有多種組織修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)成分以及各種調(diào)控因素的參與，這些相關(guān)因素形成網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控創(chuàng)面的愈合。在調(diào)控創(chuàng)面愈合眾多因素中，Smads通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β、TGF-βs）超家族的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，而在創(chuàng)面愈合的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制中起到不容忽視的作用。本研究通過對大鼠創(chuàng)面模型局部外用TGF-β/Smads拮抗劑IFN-γ，了解Smad7在大鼠創(chuàng)面愈合過程中的變化規(guī)律。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：干擾素γ（IFN-γ）購自上海克隆生物高技術(shù)有限公司、Smad7抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。S-P即用型試劑盒、DAB顯色液、PBS液（pH= 7.2～7.4）購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。BH-2型OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、LKB-B型超薄切片機(jī)、CM2000Ｃ北航醫(yī)學(xué)病理圖像分析儀等由昆明醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理教研室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組：選取成年SD大鼠127只，雌雄不限，體重0.18～0.2kg。隨機(jī)分成A、B、C、D、E共5組，每組25只，正常對照組2只，單籠飼養(yǎng)。所有手術(shù)操作均在無菌條件下進(jìn)行，以30g/L戊巴比妥鈉（35mg/kg）腹腔注射麻醉，將大鼠背部兩側(cè)剪毛，常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備消毒。在大鼠背部剪去四塊大小為1cmx1cm的全層皮膚，形成缺損，創(chuàng)面間隔2cm，125只大鼠無死亡。每日分別外用IFN-γ溶液 和0.9%生理鹽水換藥：A組用0.9％生理鹽水；B組用IFN-γ500U/ml溶液；C組用IFN-γ 1000U/ml溶液；D組用2000U/ml溶液；E組為空白組，即傷后不作任何處理。

1.3 取材和染色：分別于術(shù)后第3、7、10、14、21日隨機(jī)選取各組5只大鼠采用過量麻醉處死，剪取創(chuàng)面肉芽組織，范圍包括周圍正常組織，深達(dá)肌層。分別行蘇木素－伊紅常規(guī)染色（HE染色）和免疫組化染色。觀察HE染色切片，40倍光鏡下選取不重疊的三個視野，以計算機(jī)顯微測微尺測量新生肉芽組織厚度，同法在200倍光鏡下，目測計數(shù)成纖維細(xì)胞。免疫組化染色（SP染色）后，在高倍鏡（×400）下，用圖像分析儀對Smad7陽性細(xì)胞進(jìn)行平均光密度、平均灰度的測量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS13.0 for windows 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行方差分析和兩兩比較q檢驗(yàn)，處理檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，P<0.05差異具有顯著性。

2結(jié)果

2.1 新生肉芽組織厚度：40倍光鏡下觀察，各組別新生肉芽組織于術(shù)后第3天開始形成，厚度于術(shù)后第7天增厚明顯，第10天達(dá)峰值，第14天開始下降，第21天接近正常大鼠皮膚。各時間點(diǎn)A、B組肉芽組織厚度較C、D組致密且厚，組間比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。E組肉芽組織厚度介于A、B組和C、D組之間，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 成纖維細(xì)胞計數(shù)：200倍光鏡下，在創(chuàng)面肉芽組織中選取3個不重疊視野，目測計數(shù)成纖維細(xì)胞，術(shù)后第3、21天，各組別成纖維細(xì)胞數(shù)量無差異（P＞0.05）。傷后第7、10、14天，A、B組成纖維細(xì)胞數(shù)量比C、D、E組明顯增多（P＜0.001）。各組內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)均在第10天達(dá)到高峰，不同時間點(diǎn)成纖維細(xì)胞計數(shù)差異具有顯著性（方差分析P＜0.001）。

2.3 創(chuàng)面愈合中Smad7的表達(dá)：免疫組化染色后，成纖維細(xì)胞胞漿、胞核均呈陽性染色，即呈淺棕色至棕黑色細(xì)顆粒狀，新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈淺棕色。Smad7在術(shù)后第3天、第14天表達(dá)較強(qiáng)，在成纖維細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在C、D組中各時相的表達(dá)強(qiáng)于A、B、E組，差異有顯著性（P＜0.001），但C組和D組、A組和B組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Smad7在E組中各時相的表達(dá)均介于C組和D組、A組和B組之間，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

各時相Smad7平均灰度如表4示：C、D組與A、B組之間差異有顯著性（P＜0.001）,E組分別與A、B組和C、D組之間存在差異，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有意義（P＜0.01）。但是，A組和B組間，C組和D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Smad7的表達(dá)于傷后第3、14天最強(qiáng)，第7天表達(dá)最弱。

3討論

Smad Smad是Mad和Sma蛋白及其類似物的統(tǒng)稱,即Smad(Sma-Mad)族蛋白，是細(xì)胞內(nèi)特異轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β調(diào)控信息的信號傳遞分子[1]。目前,已發(fā)現(xiàn)8種Smad分子,其中Smad2,3,4,6,7與TGF-β的信號調(diào)控最為密切。這5種Smad按其功能分為3類:①受體調(diào)節(jié)Smad，即Smad2與Smad3。配體與受體結(jié)合后,即能磷酸化Smad2,Smad3使其激活；②共用Smad,即Smad4。Smad2與Smad3激活磷酸化后必須與Smad4形成復(fù)合物,才能遷移至胞核中促進(jìn)靶基因表達(dá)；③抑制性Smad,包括Smad6和Smad7。

目前對于Smad7阻斷TGF-β信號通路,開展對器官纖維化的實(shí)驗(yàn)研究已引起廣大學(xué)者的極大興趣。近來有作者[2]將含有小鼠Smad7cDNA的重組腺病毒載體導(dǎo)入由博萊霉素所誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型體內(nèi),發(fā)現(xiàn)ColⅠmRNA、羥脯氨酸含量降低及組織病變程度減輕。Terada等[3]也通過構(gòu)建Smad7基因的病毒載體實(shí)施對腎纖維化動物模型作基因治療的嘗試,發(fā)現(xiàn)Smad7可抑制腎間質(zhì)纖維化的程度。王丹茹等[4]，將外源的Smad7基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),加強(qiáng)內(nèi)源Smad7的作用,阻斷通路,有效地下調(diào)了TGF-β的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，減少其自身基因表達(dá)。Smad7的表達(dá)可以受到其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，比如, IFN-γ通過Jak1酪氨酸蛋白激酶和Stat1轉(zhuǎn)錄因子可以增強(qiáng)Smad7的表達(dá),這就可以解釋TGF-β和IFN-γ在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能時的相互拮抗作用。因此，增加IFN-γ可通過 Jaks-Stats通道上調(diào)Smmad7，而達(dá)到抑制TGF-β的作用。

由結(jié)果可知，與新生肉芽組織厚度和成纖維細(xì)胞計數(shù)結(jié)果相一致的是：局部外用IFN-γ（1000U/ml或2000 U/ml）可使創(chuàng)面內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量減少、新生肉芽組織厚度減少、創(chuàng)面愈合時間延長。因此，我們可推測IFN-γ對于創(chuàng)面愈合的影響可能是通過以下途徑實(shí)現(xiàn)的：抑制成纖維細(xì)胞的生長增殖，導(dǎo)致新生肉芽組織厚度減少、增生緩慢，從而影響創(chuàng)面愈合。

本實(shí)驗(yàn)可看出，使用外源性IFN-γ后，Smad7在劑量組C組（1 000U/ml）和D組（2 000 U/ml）中的表達(dá)較A組（鹽水組）、B組和E組（空白組）增強(qiáng)。B組（500U/ml）與A組（對照組）比較各指標(biāo)都無統(tǒng)計學(xué)意義，而C、D組各指標(biāo)值均比A組或B組有降低或減少，表現(xiàn)出顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，可能C組（1 000U/ml）是大鼠創(chuàng)面組織發(fā)生變化的有效起始濃度。當(dāng)IFN-γ濃度增加到D組（2 000U/ml）時仍然對創(chuàng)面組織產(chǎn)生明顯的作用，但是和C組比較沒有明顯的差別。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外用IFN-γ后，C組和D組Smad7表達(dá)強(qiáng)于A組和B組，由此可認(rèn)為當(dāng)外用IFN-γ在濃度為1 000U/ml和2 000U/ml時可通過Jak-Stat通路上調(diào)Smad7。IFN-γ在濃度為500 U/ml時，可能由于濃度較低未達(dá)大鼠創(chuàng)面用藥的起始濃度。空白組E組在創(chuàng)面不做任何處理的情況下，Smad7的表達(dá)仍強(qiáng)于A、B組（P＜0.05），這可能是于E組在創(chuàng)面自然愈合過程中，由于炎性反應(yīng)較A組和B組強(qiáng)，部分炎性因子如：白細(xì)胞介素-1（ IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF）也可通過NF/RelA轉(zhuǎn)錄因子刺激Smad7的表達(dá)，從而阻斷TGF-β1的信號傳導(dǎo)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，各組內(nèi)Smad7平均光密度和平均灰度的改變基本呈一致性。Smad7在傷后第3天、第14天表達(dá)較強(qiáng)，在成纖維細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，于第21天下降達(dá)正常水平。由于目前對于大鼠皮膚創(chuàng)面通過局部外用IFN-γ來阻斷TGF-β/Smad通路尚無報道，因此，可在今后實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步探討其藥理規(guī)律。有目的地調(diào)控和干預(yù)TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,有助于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與胚胎發(fā)育,減輕瘢痕及纖維疾病,加深對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的理解和認(rèn)識[5]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Roberts AB.TGF-beta signaling from receptors to nucleus[J]. Microbes Infect, 1999, 1:1265-1273.

[2]Nakao A, Fujii M, Matsumura R, et al. Transient gene transfer and expression of Smad7 prevents bleomycin-induced lung fibrosis in mice[J]. J Clin Invest, 1999, 104-105.

[3]Terada Y, Hanada S, Nakao A, et al .Gene transfer of Smad7 using electroporation of adenovirus prevents renal fibrosis in post-ob-structed kidney[J]. Kidney Int Suppl,2002:61,94.

[4]王丹茹,劉偉. Smad7過度表達(dá)抑制3T3細(xì)胞增殖和TGF-β1基因表達(dá)[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2003,23(1):35-38.

[5]楊力,李薈元. Smad蛋白家族與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J]. 中國美容醫(yī)學(xué),2001,10(6):547-549.

[收稿日期]2008-09-18[修回日期]2009-1-5

編輯/張惠娟