血管內(nèi)皮生長因子１６５基因轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞異位成骨的初步研究

高全文　柳春明　宋慧鋒　柴家科

[摘要]目的：將血管內(nèi)皮生長因子165（VEGF165）基因轉(zhuǎn)染的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）和β-磷酸三鈣復(fù)合后，植入原大鼠肌肉中，探索轉(zhuǎn)染外源基因的MSCs異位成骨能力。方法：SD大鼠12只，在全麻及無菌條件下取其左側(cè)股骨的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并用礦化液誘導(dǎo)培養(yǎng)。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體pcDNA3.1- VEGF165轉(zhuǎn)染到誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs，G-418篩選陽性細(xì)胞克隆，將陽性克隆細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的MSCs共同接種于β-磷酸三鈣上，體外培養(yǎng)7天后，植入原大鼠肌肉內(nèi)。分別于4周、8周和12周處死動物，觀察異位成骨情況。結(jié)果：骨髓基質(zhì)細(xì)胞－β-磷酸三鈣復(fù)合體植入肌肉后，材料周圍血管生長較多，隨著植入時間的延長，小的骨島逐漸融合為大的骨塊，并有骨髓腔樣結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較好的異位成骨能力。結(jié)論：應(yīng)用VEGF165基因轉(zhuǎn)染MSCs作為種子細(xì)胞植入體內(nèi)后，有利于發(fā)揮VEGF165的血管化作用，同時促進(jìn)組織工程骨的成骨速度，將會成為組織工程骨血管化探索的方向。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長因子165；骨髓基質(zhì)細(xì)胞；β-磷酸三鈣

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）01-0069-03

A primary study on the osteogenic characteristic of MSCs with VEGF165 gene

GAO Quan-wen1,LIU Chun-ming,SONG Hui-feng,CHAI Jia-ke

（1.Department of Burn and Plastic Surgery，the First Hospital Affiliated to PLA General Hospital, Beijing 100037，China; 2.Department of Plastic Surgery, PLA General Hospital，Beijing 100853，China）

Abstract： ObjectiveTo investigate the osteogenic characteristic in vivo of rat bone marrow stroma cells (MSCs) with Vascular endothelial growth factor 165 gene (VEGF165) combined onto β-tricalcium phosphate（β-TCP）.MethodsMSCs were obtained from femurs of 12 SD rats under general anesthesia and sterile condition, and cultured in DMEM supplemented with 10%FBS. MSCs were cultured in a conditional medium in subculture including: dexamethasone, vitamin C, and β-glycerophosphate. At the same time, we constructed the eukaryotic expression vector containing VEGF165gene. VEGF165 gene was transfected into MSCs by means of LipofectAMINE?2000. The stably gene expressive cells were screened with G-418 for 14 days. The cell mixture were combined onto β-TCP and cultured in vitro for 7 days. The cells-ceramic compound was implanted intramuscularly into the corresponding rat. These rats were executed after 4w, 8w, 12w.The osteogenic characteristic in vivo were investigated by histochemistry.ResultsAs the time passed, much osseous island changed large osseous block. It showed that the cells-ceramic compound implanted intramuscularly could be osteogenesis.ConclusionWhen VEGF165 gene was transfected into MSCs, there were blood vessel around the osseous island. VEGF165 could improve vessels growth and accelerate osteogenic of tissue engineering bone. The experiment was an interesting research of vascular tissue engineering bone.

Key words：vascular endothelial growth factor 165; bone marrow stroma cells; β-tricalcium phosphate

骨缺損的治療一直是臨床上棘手的問題。近年來，由種子細(xì)胞和生物材料組成的組織工程骨研究進(jìn)展迅速，為解決骨缺損提供了探索方向。但是，組織工程骨面臨迅速血管化的重要問題，同其他類型移植骨一樣，充分的血液供應(yīng)是保證組織工程骨在體內(nèi)存活的決定因素。Ferrara[1]等研究認(rèn)為VEGF165是體內(nèi)促進(jìn)血管生長的主要因子。為此，本實(shí)驗(yàn)將VEGF165基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞到骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，并就VEGF165影響成骨的特點(diǎn)進(jìn)行初步探索。

1材料和方法

1.1 試劑與材料：DMEM培養(yǎng)液購自Gibco，限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、Xho I及T4 DNA連接酶，均購自TaKaRa(大連)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自華舜公司。鼠抗人血管內(nèi)皮生長因子單抗（mAb）購自福建邁新公司。E.coli DH5α、質(zhì)粒pcDNA3.1及pSP73-VEGF165，均為第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室李福洋博士惠贈。G418和脂質(zhì)體LipofectAMINE2000購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)：150g成年雄性SD大鼠12只，3％戊巴比妥鈉腹腔注射全麻后，取左側(cè)股骨和脛骨。在超凈臺中將骨髓細(xì)胞沖入DMEM培養(yǎng)液中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液，以后每隔2天換液1次。第8天，用礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)持續(xù)1周，骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞行傳代培養(yǎng)。

1.2.2真核表達(dá)載體pcDNA3.1-VEGF165的構(gòu)建 具體過程詳見文獻(xiàn)[2]。

1.2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)下VEGF165轉(zhuǎn)染MSCs：于轉(zhuǎn)染前1 天，將原代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞用2.5g/L的胰酶消化、計(jì)數(shù)，并按1×109 細(xì)胞/L 接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞長滿至90%～95%時，將pcDNA3.1- VEGF165轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染的空白對照），具體操作按LipofetAMINE2000試劑盒中的說明書進(jìn)行，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h (期間不必?fù)Q液)。翌日，以G418（300 mg/L）進(jìn)行篩選，3天換液1次，培養(yǎng)14 天后，獲得陽性細(xì)胞克隆。

1.2.4 MSCs與β-磷酸三鈣復(fù)合體的構(gòu)建：將體積為5mm×2mm×2mm的β-磷酸三鈣24塊用蒸餾水洗凈，超聲凈化2次×20min，自然干燥，高壓滅菌。VEGF165基因轉(zhuǎn)染的MSCs經(jīng)G418篩選后，將轉(zhuǎn)染MSCs收集達(dá)到所需細(xì)胞密度（5×106），種植到β-TCP上。然后，MSCs-β-磷酸三鈣復(fù)合體置入37℃、5%CO2孵箱，培養(yǎng)7天，隔日換液。

1.2.5 MSCs-β-磷酸三鈣復(fù)合體異位種植：在全麻下將MSCs-β-磷酸三鈣復(fù)合體各2塊分別回植到每只大鼠背部的肌肉內(nèi)，分別于4周、8周及12周各處死大鼠。植入標(biāo)本經(jīng)脫鈣、浸蠟、透明、石蠟包埋、連續(xù)切片，厚度為5μm，制成組織切片標(biāo)本，進(jìn)行HE染色觀察。

2結(jié)果

2.1 大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性：原代培養(yǎng)時，大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長穩(wěn)定，增殖速度快。原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞于24～48h貼壁，開始為小的圓形細(xì)胞，培養(yǎng)6～7天時出現(xiàn)90%的融合，呈散在的集落狀生長，并圍繞集落中央呈島狀放射樣排列(圖1)。

2.2G418篩選的陽性細(xì)胞克隆：以pcDNA3.1-VEGF165轉(zhuǎn)染骨髓骨髓基質(zhì)細(xì)胞后24h，加入G418進(jìn)行篩選。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在1 周內(nèi)全部死亡；而轉(zhuǎn)染的細(xì)胞2 周內(nèi)10%～20%細(xì)胞存活，呈克隆狀生長 (圖2) 。

2.3MSCs與β-TCP植入體內(nèi)的成骨特點(diǎn)：植入體內(nèi)第4周，可見小骨島，呈散在分布，在小骨島的周圍可見大量的成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞體積較大，形態(tài)不規(guī)則。未降解的β-磷酸三鈣在脫鈣時被溶解而余下空白區(qū)域(圖3)。植入第8周，標(biāo)本的成骨量增多，相互融合成片，成骨細(xì)胞被包埋在骨基質(zhì)中，出現(xiàn)板層骨，血管緊貼在新生板層骨周圍（圖4）。植入后12周，移植材料逐漸被新生骨組織取代，成骨量明顯增大，并有骨髓腔樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，可見骨細(xì)胞胞體呈橢圓形，胞核較大，骨陷窩明顯（圖5）。

3討論

如何在構(gòu)建組織工程化骨組織的同時重建其血液供應(yīng)成為骨組織工程從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用過渡的關(guān)鍵性問題。目前有關(guān)骨組織工程血管化的研究尚處于起步階段，主要方法有：①成骨細(xì)胞+血管內(nèi)皮細(xì)胞+生物材料；②成骨細(xì)胞+生物材料+血管束植入；③成骨細(xì)胞+生物材料+筋膜瓣；④成骨細(xì)胞+生物材料+帶血管蒂的組織瓣包埋等。Tsurumi等[3]應(yīng)用VEGF真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔動脈壁，發(fā)現(xiàn)側(cè)枝循環(huán)明顯增加。Baumgartner等[4]進(jìn)行VEGF基因治療肢體缺血性疾病的臨床試驗(yàn)，并取得了良好的效果。

研究表明，β-磷酸三鈣（β-TCP）具有良好的骨引導(dǎo)活性，將其植入大鼠股骨上的骨缺損中，術(shù)后4天即有細(xì)胞侵入材料內(nèi)部，術(shù)后1周時即有骨組織在材料周圍形成，骨直接沉積在材料表面[5]。程曉兵等[6]將塊狀β-TCP埋入兔顱骨骨膜下，觀察其在光滑的骨皮質(zhì)表面的骨引導(dǎo)作用，結(jié)果表明，β-TCP具有良好的表面骨引導(dǎo)作用，新生骨與骨床結(jié)合良好。本研究中應(yīng)用的 -TCP是由荷蘭Isotis生物材料研究所提供的有孔磷酸鈣陶瓷，平均孔徑200μm，含孔率60%。該生物材料是細(xì)胞生長良好的載體，它與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的三維復(fù)合體植入體內(nèi)后產(chǎn)生較好的異位骨形成能力。

本實(shí)驗(yàn)利用VEGF165的促進(jìn)微血管生長的作用，將轉(zhuǎn)染VEGF165的自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為種子細(xì)胞，與β-TCP復(fù)合后進(jìn)行體內(nèi)成骨能力研究。因轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量較少，需將未轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞與轉(zhuǎn)染細(xì)胞混合，以達(dá)到足夠的細(xì)胞濃度（≥5×106/ml）。植入后4周，可見移植材料周圍有大量的成骨細(xì)胞，并有少量的血管長入；植入后8周，血管緊貼在新生板層骨周圍，成骨量明顯增大，并有骨髓腔樣結(jié)構(gòu)。這些可以說明兩個問題：①骨的形成過程與血管密切相關(guān)，如果沒有血管的長入，植入的細(xì)胞就無法獲得充分的營養(yǎng)供應(yīng)，骨形成能力將會受到影響[7]；②轉(zhuǎn)染VEGF165的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)生長的同時分泌VEGF165，而分泌的VEGF165促進(jìn)微血管生長，使植入物周圍的血管盡快長入材料中，從而加速骨形成的過程。MSCs轉(zhuǎn)染VEGF165基因后植入體內(nèi)后，可以發(fā)揮VEGF165的促血管生長作用，成為組織工程骨血管化探索的方向。但是，VEGF165基因參與成骨的量和方式以及血管化的過程仍需要深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothellial cells [J]. Biochem Biophys Res commun, 1989, 161:851-855.

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[3]Tsurumi Y, Kearney M, Chen D, et al. Treatment of acute limb ischemia by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor gene[J]. Circulation, 1997, 96(suppl Ⅱ):382-386.

[4]Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia[J]. Circulation, 1998, 97:1114-1119.

[5]高全文,楊連甲,梁立民,等.大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞與β-磷酸三鈣體外復(fù)合培養(yǎng)[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2006,20(2):155-156.

[6]程曉兵,薛振恂,周樹夏,等. 多孔塊狀β-磷酸三鈣陶瓷兔骨膜下埋置引導(dǎo)成骨的定量研究[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 1998, 14(4):256-258.

[7]王金明,章慶國,張嬌.溫固化水凝膠負(fù)載骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國美容醫(yī)學(xué),2008,17(3):389-392.

[收稿日期]2008-08-21[修回日期]2008-12-15

編輯/張惠娟