蘋果自交不親和基因PCR擴增程序優化v

陳 超 于葆杰 李保國

摘要:通過研究PCR反應體系(DNA、Primer、Mg2+、dNTP、 Taq聚合酶、buffer)及退火溫度對蘋果自交不親和基因(S基因)擴增結果影響的分析,構建了適合于蘋果自交不親和基因的PCR擴增程序的優化體系。結果表明:在20 μL的反應體系中,模板DNA的最適含量為40 ng,dNTP最適濃度為0.25 mmol/L,而Primer最適濃度為0.4 μmol/L,Mg2+的最適濃度為2.5 mmol/L,Taq聚合酶最適濃度為1 U,buffer最適濃度為1×buffer,最適退火溫度為50 ℃。

關鍵詞:蘋果;S基因;PCR體系優化

中圖分類號:S661.1; Q503文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.04.008

Optimized Study on PCR Amplification Procedure of the Apple Self-incompatibility Gene

CHEN Chao1,YU Bao-jie1,LI Bao-guo2

(1.Forestry Science Institute of Cangzhou,Cangzhou,Hebei 061001,China;2. Forestry College,Hebei Agricultural University,Baoding,Hebei071000,China)

Abstract:Through analyzing the effect of PCR system (DNA, Primer, Mg2+, dNTP, Taq polymerase, and buffer) and annealing temperature on amplification of apple self-incompatibility gene (s-gene), we constructed a optimized system of PCR amplification procedure which was fit for apple self-incompatibility gene. The result showed that the optimized content in 20 μL system contained 40 ng DNA template, 0.25 mmol/L dNTP, 0.4 μmol/L primer, 2.5 mmol/L Mg2+, 1 U Taq polymerase, 1×buffer, and the optimized annealing temperature was 50 ℃.

Key words: apple;s-gene;optimized PCR system

蘋果自交不親和是在長期的生物進化過程中形成的自我保護機制。但是,對蘋果栽培生產卻有很大影響。隨著分子生物學技術的發展,查明蘋果的自交不親和是由S基因控制的[1]。利用PCR技術可以進行特異基因的擴增,但目前對蘋果S基因PCR擴增的研究報道極少,采用常規的PCR反應體系難以獲得較高濃度的產物,不能進行正常回收鑒定。因此,筆者對蘋果S基因PCR擴增程序進行了優化研究。

1材料和方法

1.1材料

2004年5月上旬,于河北農業大學果樹標本園采集富士蘋果新梢頂端完全展開的第1~2片幼葉,液氮速凍后置于-70 ℃冰箱保存備用。

1.2方法

基因組DNA提取參照CTAB法[2],DNA質量和濃度的檢測用薩姆布魯克[3]的方法。引物按Shogo matsumoto[4]的設計合成,其上游引物為:5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3',下游引物為:5'-ACGTTCGGCCAAATA/CATT-3',由寶生物工程(大連)有限公司合成。

PCR反應體系及熱循環條件在Ishimizu T[5]的基礎上進行優化試驗。在20 μL PCR反應體系中,DNA模板含量設5,10,20,40,60,80 ng 6個濃度梯度;Mg2+濃度設1,1.5,2,2.5,3,3.5,4 mmol/L 7個濃度梯度;TaqDNA聚合酶設0.5,1,2.5,5,7,15 U 6個濃度梯度;dNTP濃度設0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.4 mmol/L 6個濃度梯度;引物濃度分別設0.1,0.2,0.25,0.3,0.4,0.5 μmol/L 6個濃度梯度;buffer濃度設0.5×buffer、1×buffer、2×buffer、3×buffer、4×buffer、5×buffer 6個濃度梯度;退火溫度設41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52 ℃共12個溫度梯度。

2結果與分析

2.1不同DNA模板含量對蘋果S基因的PCR擴增的影響

不同DNA模板含量對蘋果S基因的PCR擴增結果如圖1所示。由此表明,在DNA模板含量5～40 ng都得到了較好的擴增,說明DNA模板含量在此范圍內對蘋果S基因PCR擴增結果影響較小,5 ng即可滿足擴增需要。隨著模板含量的增加,擴增條帶的亮度有所增強,以40 ng擴增效果最好,當DNA含量達到60～80 ng時擴增條帶亮度變弱且寬度變小。因此認為,進行蘋果S基因的PCR擴增時DNA模板含量以40 ng為宜。

2.2不同Mg2+濃度對蘋果S基因的PCR擴增的影響 不同Mg2+濃度條件下蘋果S基因的PCR擴增結果如圖2所示。由此表明,當Mg2+濃度為1.0 mmol/L時擴增條帶少而且弱,隨著濃度的增加,特異性結合增強,擴增條帶越來越清晰;當濃度達到4 mmol/L時,特異性降低,出現一些非特異性條帶,使擴增的條帶變寬;Mg2+濃度在1.5～3.0 mmol/L之間均能獲得清晰穩定的條帶,以濃度在2.5 mmol/L最好。因此認為,進行蘋果S基因的PCR擴增時Mg2+濃度以2.5 mmol/L為宜。

2.3不同dNTP濃度對蘋果S基因的PCR擴增的影響

不同dNTP濃度對蘋果S基因的PCR擴增結果如圖3所示。由此表明,dNTP濃度從0.1～0.3 mmol/L均能擴增清晰的條帶,以0.25 mmol/L時擴增條帶最清晰,濃度達0.4 mmol/L時擴增條帶變弱。因此認為,進行蘋果S基因的PCR擴增時dNTP濃度以0.25 mmol/L為宜。

2.4不同引物濃度對蘋果S基因的PCR擴增的影響

不同引物濃度對蘋果S基因的PCR擴增結果如圖4所示。由此表明,引物濃度為0.1 μmol/L時沒有擴增產物,濃度為0.2～0.3 μmol/L時擴增條帶不清晰,說明在引物濃度較低時,擴增產物效率低;在0.3～0.4 μmol/L時較好,以0.4 μmol/L最佳。因此認為,進行蘋果S基因的PCR擴增時引物濃度以0.4 μmol/L為宜。

2.5不同Taq聚合酶濃度對蘋果S基因的PCR擴增的影響

不同Taq聚合酶濃度對蘋果S基因的PCR擴增結果如圖5所示。由此表明, Taq聚合酶濃度在0.5～1 U時,能夠得到條帶清晰、特異性強的擴增產物,以1 U時最佳;在0.25～15 U時,有一些非特異性條帶得到了擴增。因此認為,進行蘋果S基因的PCR擴增時Taq聚合酶濃度以1 U為宜。

2.6不同buffer濃度對蘋果S基因的PCR擴增的影響

不同buffer濃度對蘋果S基因的PCR擴增結果如圖6所示。由此表明,當buffer濃度為0.5×buffer、1×buffer、2×buffer時,能夠得到特異性強而且清晰的條帶。以后隨著buffer濃度的增加, PCR擴增產率降低。1×buffer時條帶清晰,特異性好。因此認為,進行蘋果S基因的PCR擴增時buffer濃度以1×buffer為宜。

2.7不同退火溫度對蘋果S基因的PCR擴增的影響

不同退火溫度對蘋果S基因的PCR擴增結果如圖7所示。由此表明,溫度在47 ℃以下時擴增條帶輪廓不清且出現非特異性條帶;在48～50 ℃之間時出現了鮮明的譜帶,且特異性很強;在51 ℃以上時,得不到擴增產物。試驗結果說明,退火溫度太低,有條帶模糊不清或擴增效率下降的趨勢;而退火溫度太高,幾乎看不到擴增產物。可見,只有在溫度允許的范圍內,適當提高退火溫度,可以提高PCR反應的特異性,使擴增條帶清晰。因此認為,進行蘋果S基因的PCR擴增時退火溫度以50 ℃為宜。

3結論與討論

本試驗結果表明,蘋果S基因PCR最優化反應體系為:總體積20 μL時,DNA模板含量為40 ng,Mg2+濃度為2.5 mmol/L,引物濃度為0.4 μmol/L, dNTP濃度為0.25 mmol/L,Taq聚合酶濃度為1 U,buffer濃度為:1×buffer,退火溫度為50 ℃。

PCR對DNA質量要求不高[6],當DNA模板含量在5～40 ng范圍內均擴增出清晰條帶,說明蘋果DNA模板含量在此范圍內不會影響蘋果S基因的PCR擴增結果。但當DNA含量超出此范圍以后,隨著DNA含量的提高,擴增條帶不清晰。因為,當DNA含量超過60 ng以后,由于引物濃度相對較少,在PCR反應過程中高濃度的DNA對引物有競爭作用,可能對引物有一定的分散效應,使擴增產率降低。

參考文獻:

[1] Kobel F,Steinegger P,Anliker J. Wertere untersuchungen uber die befruchung sverhaftnisse der apfel und birnsorien[J].Landw Jbschweiz,1939,53:160-191.

[2] 顧紅雅.植物分子生物學實驗手冊[M].北京:高等教育出版社,1998:3-12.

[3]薩姆布魯克 J,拉塞爾D W.分子克隆實驗指南[M].北京:科學出版社,2002:387-400.

[4] Matsumoto S, Kitahara K. Discovery of a new self-incompatibility allele in apple[J]. HortScience,2000,35(7):1329-1332.

[5] Ishimizu T, Inoue K, Shimonaka M, et al. PCR-based method for identifying the S-genotypes of Japanese pear cultivars[J]. Theor Appl Genet,1999(98):961-967.

[6] Saiki R K, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia [J].Science,1985, 230(4732):1350-1354.