枯草芽孢桿菌H4培養條件的優化

李亞玲 趙玉潔 謝鳳行 周 可 張峰峰

摘要:以枯草芽孢桿菌H4為試驗材料,利用Plackett-Burman設計法,對影響菌體生長的7個因素進行了篩選,確定影響該菌生長的主要因素為牛肉膏、轉速、蛋白胨和NaCl;采用響應面分析法對其中3個重要因子的最佳水平進行研究。結果表明,當牛肉膏為8.635 g/L,蛋白胨為13.737 g/L,NaCl為5.345 g/L,接種量6.25%,初始pH7,溫度39 ℃,轉速150 r/min培養時,菌體密度顯著提高,菌株H4的OD460值由0.899提高到了1.129。

關鍵詞:枯草芽孢桿菌;Plackett-Burman設計;響應面分析法;優化

中圖分類號:Q939.124文獻標識碼:B DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.04.007

Optimization of Growth Conditions of Bacillus Subtilis H4

LI Ya-ling,ZHAO Yu-jie,XIE Feng-xing,ZHOU Ke,ZHANG Feng-feng

(Tianjin Research Center of Agriculture Biotechnology,Tianjin 300192,China)

Abstract:A strain of Bacillus subtilis H4 was isolated from the mud of pound, and the Plackett-Burman design was used to study the 7 factors influencing the growth of Bacillus subtilis H4. The results showed that beef extract, rotational speed, peptone and NaCl were the main factors. Response surface methodology was also used to research the optimization for the 3 main factors, and the results indicated that the concentration of Bacillus subtilis H4 was significantly increased and the OD460 of the broth increased from 0.899 to 1.129 under the condition of beef extract 8.635 g/L, peptone 13.737 g/L, NaCl 5.345 g/L, inoculation 6.25%, initial pH7, temperature 39 ℃ and rotational speed 150 r/min.

Key words: Bacillus subtilis;Plackett-Burman design;response surface method;optimization

隨著水產養殖業的迅猛發展和集約化經營程度的不斷提高,養殖水體污染日趨嚴重,許多養殖池中有害藻類及病菌大量繁殖,水質條件不斷惡化,其后果影響到了水產品安全和產業的可持續發展[1]。利用常規藥物防治方法,不但易加重水質惡化程度,成本也較高,而利用微生物制劑改善養殖水體環境受到人們越來越多的關注[2,3]。枯草芽孢桿菌是一種好氧的革蘭氏陽性菌[4],在自然界廣泛存在,生命力極強,代謝旺盛,對人畜無害,不污染環境,具有廣譜的抗菌活性和極強的抗逆能力[5-7]。枯草芽孢桿菌能有效的降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽和硫化物[8-10],達到凈化水質的目的。因此,枯草芽孢桿菌在養殖水體的生物修復方面得到了廣泛的應用。

用枯草芽孢桿菌H4發酵后經離心的菌體處理模擬養殖水,結果表明,H4能有效降解水體中的亞硝酸鹽、氨氮,使水體中溶解氧含量逐漸升高。因此,菌體濃度是影響水體凈化效果的主要因子之一。鑒于培養條件對菌體生長的影響,有必要對其進行優化,以獲得較高的含菌量。本試驗采用Plackett-Burman設計和響應面分析法對枯草芽孢桿菌發酵生產的相關影響因素進行了研究,以期從眾多影響因素中快速有效地篩選出主要的影響因子,通過回歸各因素水平及其相互作用與響應值之間關系的二次多項式,對各因子進行優化,確定較優的發酵條件,為后續的擴大培養和微生態制劑的開發應用提供理論依據。

1材料和方法

1.1材 料

菌株:枯草芽孢桿菌H4為本實驗室分離保藏。

培養基:(1)液體培養基蛋白胨、牛肉膏、NaC1質量分數分別為1%、0.5%、0.5%,pH7.2～7.4;(2)固體培養基在液體培養基中加入質量分數2%的瓊脂。培養基均經過高壓1×105 Pa 滅菌20 min后,無菌分裝備用。

1.2培養條件優化試驗設計

根據有關文獻記載[11]以及本實驗室對枯草芽孢桿菌的前期研究,本次試驗選取牛肉膏、蛋白胨、NaC1等培養基成分和溫度、pH值、接種量、轉速7個因素作為考察對象,并以枯草芽孢桿菌的菌體濃度為響應值,采用Plackett-Burman設計法篩選菌體生長的關鍵因素。通過響應面分析法中的中心組合設計,對其進行進一步研究,根據試驗值得到各因素水平及其相互作用與響應值之間關系的二次多項式,通過回歸此式對各因子進行優化,以獲得該菌生長的最佳培養條件。

2結果與分析

2.1Plackett-Burman設計確定重要因子

用MINITAB軟件創建一個Plackett-Burman實驗,每個因素取兩個水平,其中X3、X6、X9為空項用以估計試驗誤差。選用N=12的Plackett-Burman設計表考察了7個因素對菌體生長的影響,試驗設計及結果見表1。

對試驗數據進行回歸分析,結果見表2,牛肉膏、轉速、蛋白胨和NaCl是主要影響因素,溫度、pH和接種量的重要性相對較小一些。轉速反映的是溶解氧含量的高低,溶氧含量的影響將在以后的發酵罐中進行測定。因此,搖瓶試驗選定牛肉膏、蛋白胨和NaCl 3個因素進行下一步試驗。其余各因素的水平在后續試驗中的調整如下:接種量6.25%,pH7,溫度39 ℃,轉速150 r/min。

2.2最陡爬坡試驗逼近最大響應區域

Plackett-Burman試驗回歸分析確定牛肉膏、蛋白胨和NaCl為重要因素,且這3種組分對枯草芽孢桿菌的生長均是正影響,增加牛肉膏、蛋白胨和NaCl的濃度,考察發酵液OD值的變化趨勢,逼近最大響應區域。試驗設計和結果列于表3。

對于枯草芽孢桿菌的生長,溫度、pH值、轉速和接種量均固定在中心點的水平上。牛肉膏、蛋白胨和NaCl濃度對菌體的生長有積極的影響。表3列出了濃度改變的方向,即牛肉膏以濃度4.5 g/L為起點,蛋白胨以9.0 g/L為起點,NaCl以4.25 g/L為起點,分別依次增加0.5個單位。從表3中可以清楚地看出,處理6的OD值達到最大為1.035,隨后開始下降。因此,接下來的優化試驗應該在處理6附近進行。

2.3響應面分析法(RSA)確定最大響應值

最后采用響應面分析法對牛肉膏、蛋白胨和NaCl的濃度進行優化。試驗設計采用中心組合設計,響應面分析法設計的因子及水平見表4,試驗結果列于表5。

通過MINITAB軟件的響應面回歸過程對表5中的數據進行統計分析,建立二次響應面回歸模型,并進而求解最優響應因子水平。經過整理,所得的分析結果見表6。試驗數據擬合所得二次多項式方程為:

y=1.033 00+0.036 36X1+0.029 84X2+0.001 18 X3-0.014 17X12-0.009 22X22-0.004 44X32-0.014 38 X1X2-0.004 12X1X3-0.003 62X2X3

此方程二次項系數均為負值,拋物線的開口向下,因而有極大值點。模型的完備性可由方差分析及決定系數兩方面考察,方差分析表明:F回歸=33.14>F9,10,0.01=4.95,表明模型在α=0.01水平上回歸顯著。決定系數R2=0.968,表明模型能解釋96.8%菌液生長OD值的變化,回歸擬合程度較好。方程給枯草芽孢桿菌的發酵提供了一個合適的模型。利用MINITAB軟件繪出了計算的三維響應面,證實了擬合面有真實的最大值,見圖1。

對方程進行求導,可以得到模型的極值點為牛肉膏8.635 g/L,蛋白胨13.737 g/L,NaCl 5.345 g/L,此時模型預測的最大響應OD值為1.087。為驗證模型預測的準確性,以該最佳工藝條件進行試驗,結果見表7。由結果可知,試驗值和預測值的相對偏差小于5%,證明此模型有效,可用方程代替真實試驗點對枯草芽孢桿菌H4的培養進行分析和預測。

3結 論

本試驗通過Plackett-Burman實驗設計和響應面分析法,用較少的試驗得到與實際擬合程度較高的模型。培養條件的優化結果為:牛肉膏8.635 g/L,蛋白胨13.737 g/L,NaCl 5.345 g/L,接種量6.25%,初始pH7,溫度39 ℃,轉速150 r/min。此時模型預測的最大響應OD值為1.087。在此優化培養基的基礎上進行驗證試驗,菌株H4的OD值為1.129,比優化前的0.899提高了25.6%,菌數由9.6×108 cfu/mL提高到1.5×109 cfu/mL,芽孢數由3.8×106 cfu/mL提高到4.5×107 cfu/mL。本試驗積累的技術參數,為以枯草芽孢桿菌為主的微生態制劑的工業化生產提供了理論依據和數據支持。

參考文獻:

[1] 湯保貴,徐中文,張金燕,等.枯草芽孢桿菌的培養條件及對水質的凈化作用[J].淡水漁業,2007,37(3):45-48.

[2] 邱寶生,林煒鐵,楊繼國,等. 益生菌在水產養殖中的應用[J]. 水產科學,2004,23(7):39-41.

[3] 陳秋紅,施大林,呂惠敏,等.復合微生態制劑對水產養殖水體凈化作用的研究[J].生物技術,2004,14(4):63-64.

[4] Delphine D, Kassem H, Vincent G, et al. In situ localization and quantification of surfactins in a Bacillus subtilis swarming community by imaging mass Spectrometry[J]. Microbiology,2008(8):3682–3691.

[5] Rengpipat S, Rukpratanpom S, Piyatirativorakul S, et al. Immunity enhancement in black tiger shrimp by a probiont bacterium[J]. Aquaculture, 2000,191: 271-288.

[6] 曾地剛,雷愛瑩,彭 敏,等.枯草芽孢桿菌的分離及其凈化水質的研究[J]. 水利漁業,2007,27(6):55-56.

[7] Deepak V, Kalishwaralal S, Ramkumarpandian S, et al. Optimization of media composition for nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 8170-8174.

[8] 劉 穎,丁桂珍,胡傳紅,等. 枯草芽孢桿菌對養殖水體水質影響研究[J].淡水漁業,2004,34(5):12-14.

[9] 胡詠梅,葛向陽,梁運祥. 枯草芽孢桿菌FY99201 菌株的凈水作用[J]. 華中農業大學學報,2006,25(4):406-407.

[10] 潘亞均,胡治穩.應用枯草芽孢桿菌制劑調節南美白對蝦養殖池的水質[J].中國水產,2007(3): 97-98.

[11] 黃 宇,孫寶盛,孫井梅,等. 枯草芽孢桿菌發酵條件的研究[J].河南科學,2007,25(1): 70-72.