百子蓮的再生體系試驗初報

康 玲

摘 要:以百子蓮(Agapanthus africanus)的根莖部和葉片為外植體進行離體培養,以MS 為基礎培養基,附加不同濃度的植物生長調節劑誘導根莖部直接再生不定芽;同時以百子蓮幼嫩葉片和種子進行組織培養作對比試驗。結果表明,成熟的根莖接種在添加BA 4.0mg/L 和NAA 0.1mg/L 的MS培養基上不定芽分化率達最高,平均外植體不定芽個數在10個以上。將葉片分別接種到添加不同濃度2,4-D和MS+BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L的培養基中,結果沒有誘導出不定芽。誘導百子蓮生根實驗表明IBA對百子蓮的生根沒有促進作用。

關鍵詞:百子蓮;離體培養;根莖

百子蓮又名非洲百合,是石蒜科、百子蓮屬植物。產于南非,為一庭園花卉,廣州和北京有栽培。與花名相符的藍紫色或白色花朵浪漫誘人,細細的筒狀花向四周綻放,似高貴而優美的女性,由于歐洲人偏愛藍紫色系,故英國園林中栽培極廣,近些年來在世界各國被廣泛應用于切花生產、園林美化、藥用成分提取等方面。我國引入百子蓮屬植物的時間不長,科研成果缺乏,對其組織培養繁殖技術還未見報道。百子蓮是以分株和播種為現階段最主要的繁殖方式,但繁殖的速度慢,時間長。目前為了加快百子蓮的繁殖速度,縮短繁殖的周期,對百子蓮進行離體培養,可以大量且快速地進行繁殖。同時,對百子蓮的離體培養,建立高效穩定的離體再生體系,為百子蓮的分子育種提供理論基礎和實踐經驗。

本研究為百子蓮的組織培養的初步研究,對百子蓮不同的外植體進行參照培養,參考了火焰衛矛生根培養基為1/2MS+NAA 012mg/L。試驗最后得到一些初步結果,為百子蓮的離體快繁、無病毒苗木培育等奠定基礎,豐富了自身基礎理論,并且在實際生產中也會提高生產效率和經濟效益。

1 材料與方法

1.1無菌外植體材料的獲得

以2008年9月在河北農業大學標本園采收的百子蓮(品種A. praecox ssp. minimus ‘Storms River)飽滿種子為實驗材料。將所取材料先用清水沖洗干凈,在超凈工作臺上用70%的酒精消毒30秒,再用0.1%升汞溶液消毒種子3分鐘,最后用無菌水沖洗3~4次。將消毒完畢的種子接種于沒有附加任何植物激素的培養基,約1周后種子膨大發芽,2~3周時將幼苗的根系從根頸處切掉,切取根頸及葉片用于不定芽的誘導。

1.2不定芽的再生

將切掉根系的小苗及葉段(長1cm),接種到含不同植物激素濃度及組合的MS培養基上(激素配比見表2),所有培養基中均附加3%蔗糖及0.6%瓊脂,調節pH 5.8~6.1,121℃條件下高溫蒸氣滅菌15 分鐘。每個處理最少接種50個外植體,重復3次。接種6周后統計不定芽分化率及外植體平均不定芽個數。

1.3葉片愈傷組織的誘導

將葉片切成長約1cm的小段接種在MS附加不同濃度2,4-D(表3)的培養基上,以誘導愈傷組織。

1.4再生苗的生根

當不定芽長到3cm左右時,從基部切割下來,轉接到附加不同濃度IBA的生根培養基中進行生根培養。統計其生根率并觀察其根系的生長狀況。

1.5培養條件

所有培養均在以下條件下進行:溫度25±2℃,光照強度:1500~2000Lx,光照時間:14 小時光照,10 小時黑暗。

2 結果與分析

2.1無菌苗的獲得

將經過消毒的百子蓮種子放入MS基本培養基中,約5天開始膨大,再過約20天長成2~3cm的小苗。由表1可知,該品種發芽率比較高,但發芽不整齊,接種的第7天,只有少量的種子萌發,隨著發芽時間的延長,發芽率逐漸提高,當接種3周左右時,其發芽率達到最高,為90%。出現此種情況可能和種子的飽滿度有一定的關系,在以后的實驗中還需加強對種子整齊度的進一步篩選。

2.2不定芽分化的形態觀察

本研究中以根莖和葉片為外植體,但只有以根莖外植體的誘導中形成了不定芽,以葉片為外植體,沒有愈傷組織形成,也沒有不定芽。當根莖外植體接種2周后,其基部開始膨大,接種3周時有大量白色愈傷組織形成,接種4周時,有少量不定芽開始出現,繼續培養至6周時,有大量不定芽開始形成。伴隨不定芽大量形成,也有葉片生成。

2.3不同外植體、不同激素及濃度配比對不定芽形成的影響

將百子蓮根莖和葉片接種于附加不同植物生長調節物質的培養基上進行愈傷組織和不定芽的誘導。由表2可知,不同外植體的不定芽再生能力有很大差異。不同濃度的KT和NAA組合根莖、葉片為外植體均沒有不定芽的形成。但不同濃度的BA與0.1mg/L NAA結合,均有愈傷組織及不定芽的形成,當BA濃度為1.0 mg/L時,其不定芽再生率僅為39%,外植體平均不定芽數只有4個,生成2~3片葉;隨著BA濃度的提高,不定芽的再生率快速上升;當BA濃度為4.0mg/L時,不定芽的再生率達到最高,為95%,一般生成5~7片葉,外植體平均不定芽數目也達到最多,大多在12個以上;但當BA濃度再增加時,不定芽的再生率及外植體平均不定芽數目反而均有所下降,因此4.0 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA是百子蓮不定芽最佳的誘導體系。

2.4葉片愈傷組織誘導

以百子蓮的葉片為外植體接種在含有不同濃度的細胞分裂素和生長素的培養基上,沒有不定芽的形成,也沒有出現愈傷組織。為了建立以葉片為外植體的再生體系,試驗中再次以2,4-D作為主要生長調節劑來誘導愈傷組織的形成。本研究將細嫩的葉片切成約1 cm長的小段,接種到含不同濃度2,4-D(1mg/L, 2 mg/L, 4 mg/L和8 mg/L)的培養基中,但是各處理均沒有任何反應(數據略),可見百子蓮的葉片對植物激素的反應極不敏感,因此,還有必要進一步研究以葉片為外植體,其愈傷組織和不定芽再生所需的最佳條件。

2.5不定芽生根誘導

當根莖上再生的不定芽長到約3cm時,將其從基部切下轉入附加不同濃度IBA(0.5 mg/L、1.0 mg/L和2.0 mg/L)的生根培養基中,誘導其生根(表3)觀察發現,接種30 天時,各處理中依然沒有不定根形成,可見IBA對百子蓮的生根沒有促進作用,其最佳的生根體系還有待于進一步研究。

3討論

目前有關百子蓮近緣植物再生體系的研究有:朱頂紅(Hippeastrum)藍百合(Praeco ssp.orientalis ‘Big Blue)唐菖蒲(Gladiolus),研究表明,不同種間對外源植物激素誘導效應明顯不同。本試驗初步成功建立了百子蓮根莖離體再生體系,并發現百子蓮根莖離體再生受許多內外因素的影響。外部因素如培養基成分、植物激素的濃度及配比等對不定芽的分化影響不同,其中激素的種類和濃度尤為重要。如添加NAA+BA的培養基和添加KT培養基上的根莖有明顯的差別:添加NAA+BA的培養基無論是愈傷組織誘導率還是芽誘導率都明顯高于添加KT培養基。內部因素如植株的基因型、年齡、外植體的種類、生理狀態及大小等均影響植株的再生。一般供體植株年齡小、發育階段年幼的外植體容易再生植株。百子蓮不同部位通過離體培養最后結果各不相同:根莖部愈傷組織誘導率很高,葉片愈傷組織誘導率為0,也沒有不定芽出現,分析認為,可能是百子蓮的葉片對植物激素的反應比較遲鈍,也可能是我們的試驗組合較少,因此,還有必要對其再生所需要的條件進一步探索。

在本次誘導不定芽生根的實驗中,使用的是IBA。許多研究證明,生長素是試管苗誘導生根最重要的影響因子,它對不定根的分化是必需的。生長素影響酶的活性,增加了原生質透性,降低了原生質粘性,使代謝活動加快,核糖核酸合成加強,這一系列重要生理生化變化有利于不定根的發生和生長。較常使用的生長素主要有IBA,NAA,IAA。其中NAA對生根的作用十分強大,其啟動能力比IBA高3.7倍。IBA的作用雖弱,但不易被過氧化物酶分解,對生根有良好的效果。IAA在植物組織培養中使用的較少,因為植物組織中存在吲哚乙酸氧化酶,專門氧化分解IAA,因此本研究中未用到IAA。不過使用IBA,百子蓮組培苗生根比較困難,三個不同濃度的處理均沒有形成不定根。因此,在隨后的試驗中應以多種生長素如AA、 IAA做為百子蓮生根的生長素進行探索。

(收稿:2009-07-27)