PTD4-凋亡素融合蛋白對 Hela細胞 bak 基因表達的影響

劉鴻飛　肖琬莉　張　濤　張　強　田黎明　閆冬梅　葛堂棟　王明富

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江　佳木斯　154002)

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PTD4-凋亡素融合蛋白對 Hela細胞 bak 基因表達的影響

劉鴻飛肖琬莉張濤張強田黎明閆冬梅葛堂棟王明富

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154002)

目的研究PTD4-凋亡素(apoptin)融合蛋白對Hela細胞bak基因表達的影響。方法原核表達系統表達PTD4-apoptin融合蛋白，使用CCK8試劑盒檢測融合蛋白對Hela細胞的抑制作用；PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela細胞24 h后，提取細胞總RNA和總蛋白，采用RT-PCR和Western印跡檢測bak基因在RNA水平和蛋白水平的表達。結果PTD4-apoptin融合蛋白誘導Hela細胞bak mRNA和蛋白水平表達量較對照組均顯著提高。結論PTD4-apoptin蛋白可誘導Hela細胞凋亡，與bak基因參與凋亡調控相關。

PTD4-apoptin；bak基因；細胞凋亡

凋亡素(apoptin)是雞貧血病毒編碼的一種功能蛋白，可以選擇性誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無毒副作用。apoptin可高效抑制多種腫瘤細胞凋亡，但其誘導腫瘤細胞凋亡的機制仍不明確〔1〕。研究表明，apoptin誘導的細胞凋亡受到線粒體凋亡通路的有效調控〔2〕。bak作為 bcl-2家族中的多結構域促凋亡蛋白，是線粒體外膜通透性改變的關鍵蛋白質之一〔3〕。本研究通過考察apoptin作用 Hela細胞后 bak 基因表達量的變化，初步探討 bak 基因與apoptin誘導細胞凋亡作用的相關性。

1　材料與方法

1.1載體和細胞E.coli BL21(DE3)感受態菌購于天根生物科技有限公司，pGEX-6p-1-PTD4-apoptin質粒由本實驗室構建，人宮頸癌Hela細胞由哈爾濱醫科大學惠贈。

1.2試劑PCR 試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、蛋白 marker、4倍SDS上樣緩沖液、離心超濾濃縮管、PVDF膜購自北京索萊寶生物科技有限公司，RT-PCR試劑盒購于大連寶生物科技有限公司，GST Sefinose TM Resin 購于上海生工生物科技有限公司，bak 一抗、β-actin一抗、二抗購于武漢博士德生物有限公司。

1.3PTD4-apoptin融合蛋白的提取及活性檢測

1.3.1PTD4-apoptin融合蛋白的提取使用IPTG 誘導含pGEX-6p-1-PTD4-apoptin質粒的 Ecoli BL21(DE3)菌表達 PTD4-apoptin融合蛋白；收集菌體，PBS 緩沖液重懸菌體，超聲破碎，收集上清，0.22 μm濾膜過濾；GST親和層柱純化蛋白，使用超濾柱濃縮，更換蛋白緩沖液；用SDS-PAGE 電泳檢測蛋白提取效果。

1.3.2PTD4-apoptin融合蛋白的活性檢測收集細胞于96孔板，3 000個/孔，培養過夜后，加入 PTD4-apoptin融合蛋白，繼續培養48 h后，使用CCK8檢測試劑盒測定Hela細胞的生長狀況，分析檢測結果。以蛋白溶解緩沖液 PBS作為對照。

1.4RT-PCR檢測PTD4-apoptin作用后Hela細胞bak mRNA的表達水平收集細胞，trizol 提取 RNA，DU800測定mRNA濃度，使用逆轉錄試劑盒將bak mRNA逆轉錄成cDNA并進行PCR擴增，以β-actin作為內參照；bak上游引物：5'-ACGCTATGACTCAGAGTTCC-3'，下游引物：5'-CTTCGTACCACAAACTGGCC-3'。PCR擴增時退火溫度為59℃，循環30次，產物長度為360 bp。β-actin上游引物：5'-GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'，下游引物：5'-TGTCACGCACGATTTCCCTCTC-3'，擴增時退火溫度62℃，循環30次，產物長度為280 bp。PCR反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并分析結果。

1.5Western印跡檢測PTD4-apoptin作用Hela細胞后bak 基因蛋白表達量收集細胞，RIPA 裂解液裂解細胞，收集細胞中的總蛋白，與上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，SDS-PAGE 電泳分離蛋白條帶，將蛋白由聚丙烯酰胺凝膠轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，使用ECL發光液顯色后暗室曝光。以β-actin作為內參照。

1.6統計學方法采用SAS9.1.3軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2　結　果

2.1蛋白表達純化IPTG誘導后獲得目的蛋白，經提取純化后，SDS-PAGE凝膠電泳檢測結果顯示，與對照組相比在40 kD附近出現條帶。純化后，在該位置附近出現單一目的條帶，表明成功提取純化出 PTD4-apoptin 融合蛋白。見圖1。

2.2PTD4-apoptin 融合蛋白活性檢測PTD4-apoptin融合蛋白與Hela細胞孵育后，對Hela細胞的抑制率達93.49%，PTD4-apoptin融合蛋白對Hela細胞具有明顯抑制作用，而PBS對照組對Hela細胞并無明顯抑制作用(5%)(P>0.05)。

2.3PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela細胞后bak mRNA的表達PTD4-apoptin 融合蛋白處理Hela細胞24 h后，Hela細胞中的bak mRNA表達量明顯上調，見圖2。單因素方差分析表明PTD4-apoptin融合蛋白處理組與PBS組及空白對照組相比bak mRNA 的表達量差異顯著(P<0.001)，PBS組與空白對照組相比bak mRNA表達量無統計學差異(P>0.05)。

2.4PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela細胞后bak蛋白水平的表達PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela細胞后bak表達量顯著升高，見圖3。單因素方差分析表明PTD4-apoptin融合蛋白處理組與PBS組及空白對照組相比bak表達量差異顯著(P<0.001)，PBS組與空白對照組相比無統計學差異(P>0.05)。

M：Marker；1：pGEX-6p-1空載體蛋白;2：pGEX-6p-1-PTD4-apoptin 載體蛋白;3：過柱后蛋白提取液;4：洗柱液;5：蛋白洗脫圖1　PTD4-apoptin融合蛋白提取結果

M：Marker；1：PTD4-apoptin 融合蛋白組 2：PBS組 3：空白對照組圖2　PTD4-apoptin融合蛋白對Hela細胞bak mRNA的表達

1：PTD4-apoptin 融合蛋白作用組;2：PBS組;3：空白對照組圖3　PTD4-apoptin融合蛋白對Hela細胞bak的表達

3　討　論

有研究發現，apoptin通過上調 p73 基因的 Tap73 亞基的表達，激活 PUMA 基因，誘導線粒體途徑釋放細胞色素 C 與Caspase3 結合引起凋亡〔4〕，其誘導的腫瘤細胞凋亡作用主要通過線粒體凋亡途徑，因此，其受到線粒體凋亡途徑的相關基因的有效調控〔5，6〕。在線粒體apoptin途徑中，bcl-2 家族成員具有關鍵作用，但是目前研究表明，抑凋亡基因bcl-2的過表達并不抑制apoptin誘導的腫瘤細胞凋亡〔7〕，apoptin對促凋亡基因 bax 的表達量也無明顯影響〔8〕。bax/bak 都屬于 bcl-2家族的促凋亡基因，可調控線粒體外膜通透性〔9〕。本研究通過誘導提取獲得具有活性的 PTD4-Apoptin 融合蛋白，可顯著抑制Hela 細胞生長〔10〕，誘導Hela 細胞bak 基因表達顯著提高。結果提示 PTD4-apoptin 誘導腫瘤細胞凋亡，有可能需要通過上調 bak 基因的表達，發揮其促凋亡作用。

1武曉燕,侯玲玲,晏瓊,等.凋亡素誘導細胞凋亡的機制及其在腫瘤治療中的應用〔J〕.生理科學進展，2014；45(1)：45-8.

3梁芙蓉,秦建全,沈曉云.凋亡通路中 Bax 和 Bak 蛋白的激活模型〔J〕.生命的化學,2011;31(6):858-62.

4Taebunpakulm P,Sayan BS,Flinterman M，etal.Apoptin induces apoptosis by changing the equilibrium between the stability of Tap73 and ΔNp73 isoforms through ubiquitin ligase PIR2〔J〕.Apoptosis,2012;17(8):726-76.

5張園，朱惠明，李銀鵬，等.凋亡素基因在人肝細胞和肝癌細胞中的定位觀察及對線粒體膜電位的影響〔J〕.廣東醫學，2011;32(18)：2379-81.

6Zhou SN，Zhang MX，Zhang J，etal.Mechanisms of apoptin-induced cell death〔J〕.Med Oncol,2012;29(4):2985-91.

7阮軍,繆李麗.凋亡素與腫瘤細胞凋亡的研究進展〔J〕.中國藥房，2014；25(1):82-5.

8Li J,Wang HF,Ma Z,etal.TAT-Apoptin induces apoptosis in the human bladder cancer EJ cell line and regulates Bax,Bcl-2,caspase-3 and surviving expression〔J〕.Exp Ther Med,2012;3(6):1033-8.

9吉木斯，李存保.Bcl-2 家族在線粒體細胞凋亡途徑中的作用〔J〕.內蒙古醫科大學學報，2013； 35(2)：152-7.

10荊鑫鑫，劉鴻飛，張濤，等.PTD4-Apoptin 融合蛋白可溶性表達及其對Hela 細胞的抑制作用〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(10)：5737-9.

〔2016-02-24修回〕

(編輯郭菁)

黑龍江省自然科學基金項目(No.H201360)；黑龍江省教育廳項目(No.12531663)；佳木斯大學重大項目(No.Szp2012-01)；佳木斯大學研究生創新項目(No.LZZ2015_010)

張濤(1964-)，女，教授，碩士生導師，主要從事抗腫瘤藥物研究。

劉鴻飛(1989-)，男，在讀碩士，主要從事抗腫瘤藥物研究。

R737.33

A

1005-9202(2016)18-4419-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.007