不同山楂品種親緣關(guān)系的ＲＡＰＤ分析

摘要：為探討山楂品種間的親緣關(guān)系，采用RAPD技術(shù)對(duì)20個(gè)不同品種的山楂材料進(jìn)行了基因組DNA多態(tài)性分析。從120個(gè)引物中篩選出15個(gè)10bp的隨機(jī)引物對(duì)所選山楂品種的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到216條譜帶，177條表現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性比率達(dá)81.9％，其中包含27條特異性譜帶，揭示了山植植物豐富的遺傳多樣性。且利用NTSYS軟件和UPGMA法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行了品種間相似系數(shù)的計(jì)算及聚類分析，結(jié)果表明相似系數(shù)在0.71～0.87，實(shí)生楂與其他山楂品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：山楂；親緣關(guān)系；RAPD

中圖分類號(hào)：S661.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009—9980(2009)05—729—4

山楂(CrataegusL.)屬薔薇科蘋果亞科植物，是起源于我國(guó)的特產(chǎn)果樹(shù)。山楂品種資源豐富，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期栽培和選擇形成了豐富的變異類型。由于某些山楂品種的形態(tài)學(xué)性狀很相似，所以同名異物和同物異名現(xiàn)象十分普遍。我國(guó)山楂資源研究至今多是通過(guò)常規(guī)方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)鑒定，關(guān)于分子水平的研究報(bào)道不是很多。山東地區(qū)山楂資源豐富，在分子水平針對(duì)山東山楂的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。郭太君等利用過(guò)氧化物同工酶酶譜將山楂分為大山楂、伏山楂、秋山楂、軟籽山楂和黃果山楂5個(gè)品種群，并對(duì)伏山楂和黃果山楂植物分類地位以及品種群間的親緣關(guān)系進(jìn)行了探討。

Welsh等和Williams等利用PCR技術(shù)發(fā)展起來(lái)RAPD技術(shù)，RAPD具有技術(shù)簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、只需少量DNA樣品、不依賴于種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu)、一套引物可用于不同生物基因組分析和成本較低等優(yōu)點(diǎn)，在桃、櫻桃、蘋果、杏、梨、葡萄等多種果樹(shù)中得到廣泛應(yīng)用。但是，RAPD技術(shù)應(yīng)用于山楂的研究還極少。代紅艷等對(duì)5個(gè)野生類型和30個(gè)大果類山楂栽培變種進(jìn)行了RAPD分析，指出野生類型與栽培品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同時(shí)也證明了RAPD技術(shù)應(yīng)用于山楂品種間的親緣關(guān)系是可行的。我們選取了山東省臨沂市的20個(gè)品種進(jìn)行了RAPD-PCR分析，并構(gòu)建了遺傳樹(shù)狀圖對(duì)山楂不同品種間的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，旨在豐富該組植物系統(tǒng)學(xué)研究?jī)?nèi)容，為我國(guó)山楂種質(zhì)資源的分子生物學(xué)方面的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

采集20份山楂材料嫩葉(表1)，時(shí)間為2008-年4月初，地點(diǎn)是山東省臨沂市，將樣品貯于80℃的超低溫冰箱中備用。

1.2 總DNA提取與測(cè)定

取各品種嫩葉，采用CTAB法提取總DNA，考慮到多年生果樹(shù)富含多糖和酚類物質(zhì)的特性，在提取緩沖液中加入3％的PVP和2％的B－巰基乙醇。采用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度，測(cè)定DNA在260nm和280nm下的吸光值確定其純度，于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選

參照北京賽百盛SBS公司的引物序列，選取120個(gè)引物對(duì)少數(shù)山楂品種的DNA樣品擴(kuò)增。從中篩選出擴(kuò)增性強(qiáng)、重復(fù)性好、多態(tài)性高的15個(gè)引物(表2)，用于全部山楂品種DNA樣品的擴(kuò)增。

1.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的鑒定

由于RAPD反應(yīng)條件在物種間的較大差異性。本試驗(yàn)摸索了一套專門適合山楂PCR擴(kuò)增的程序。PCR的反應(yīng)體系如下，20μL總體積中含不少于50ngDNA模板，引物(10mmol·L^-1)1.6μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.5μL，10×Taqbuffer(含MgCl₂)2μL，TaqDNA聚合酶(2.5U·μL^-1)0.5μL，ddH₂O13.4μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，94℃變性45s、34℃退火45s、72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在1.4％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。并且實(shí)驗(yàn)用dNTP、10×Taqbuffer、TaqDNA聚合酶均購(gòu)自TIANGEN公司，實(shí)驗(yàn)用品的統(tǒng)一性確保了擴(kuò)增的穩(wěn)定性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

電泳圖譜中的每一條帶均代表了引物與模板DNA互補(bǔ)的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，可記為一個(gè)分子標(biāo)記，并估計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小。將有帶的記為1，無(wú)帶的記為0，形成0、1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。采用NTSYS-pc2.10e軟件分析了不同山楂品種的RAPD擴(kuò)增數(shù)據(jù)，得到品種間的相似度系數(shù)矩陣。根據(jù)UPGMA方法構(gòu)建聚類樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA多態(tài)性分析

表2列出了不同引物的堿基序列及其對(duì)不同山楂品種擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。從120個(gè)隨機(jī)引物中選出15個(gè)引物對(duì)20個(gè)山楂品種的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明擴(kuò)增的產(chǎn)物譜帶從9條(AS7)到23條(A4)不等，平均每個(gè)引物產(chǎn)生14條帶，共產(chǎn)生216條擴(kuò)增產(chǎn)物帶，其中177條具有多態(tài)性，比例達(dá)81.9％，充分體現(xiàn)了該組植物豐富的遺傳多樣性。擴(kuò)增產(chǎn)物的大小從120bp至2300bp不等，說(shuō)明該組植物具有豐富的多態(tài)性。引物ASl3對(duì)20個(gè)山楂品種DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 各個(gè)分類群聚類分析采用UPCMA法構(gòu)建遺傳聚類樹(shù)狀圖(圖2)，相似系數(shù)為0.71～0.87。在相似系數(shù)0.76處，毛紅香和實(shí)生楂分別獨(dú)立出來(lái)，其余可以歸為2大類。Ⅰ聚類組中包括3部分。第1部分有早面紅、大棉球和歪把紅。第2部分有橙紅甜、青條紅、小白條和五星紅，第3部分有紫肉楂、甜紅和白條紅。Ⅱ聚類組中，大金星(北王)、天寶紅、小金星、沂楂紅和花葉楂5個(gè)品種關(guān)系較近，而山里紅和冠金星相近，小甜紅最先獨(dú)立出來(lái)。

20個(gè)山楂品種DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明(表2)，其擴(kuò)增片段的數(shù)量多，特別是特異性擴(kuò)增譜帶多達(dá)27個(gè)，材料間都有不同的遺傳距離，這充分顯示了山楂物種有豐富的遺傳多樣性。在聚類樹(shù)狀圖中，早面紅、大棉球、歪把紅聚在一起，表明其親緣關(guān)系較近，從品種生物學(xué)特性上也能反映這一點(diǎn)。如3個(gè)品種的果實(shí)較大。果肉軟綿，與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的實(shí)生楂相比，后者的果實(shí)小而硬，枝刺較多，表現(xiàn)出較強(qiáng)的野生性狀：而與毛紅香山楂相比，毛紅香的果實(shí)、葉片及其枝條都布有較多茸毛，其生物學(xué)性狀有較大差別。

2.3 特異性DNA分子標(biāo)記分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，20個(gè)山楂品種中有12個(gè)產(chǎn)生了特異性的遺傳標(biāo)記。如：橙紅甜、紫肉楂、白條紅、小金星、毛紅香、大金星、青條紅、花葉楂、山里紅、冠金星、實(shí)生楂和小白條。而這些品種皆有與其他品種間區(qū)別的生物學(xué)特性，如橙紅甜的果實(shí)含糖量最高，紫肉楂的果皮和果肉均呈紫紅色，花葉楂的枝條多刺且葉子有花狀斑點(diǎn)等。

對(duì)20個(gè)引物的RAPD電泳圖譜分析發(fā)現(xiàn)，27個(gè)特異性條帶中實(shí)生楂含5條。分別為AS7擴(kuò)增的1200bp，Al擴(kuò)增的1800bp、950bp和800bp，與A4擴(kuò)增的1350bp。毛紅香也有5條特異性譜帶，分別為A1擴(kuò)增的2100bp帶、A4擴(kuò)增的2100bp和200bp帶、A18擴(kuò)增的1800bp帶和A20擴(kuò)增的2300bp帶。聚類分析結(jié)果也表明實(shí)生楂、毛紅香與其他種類的遺傳距離最遠(yuǎn)。在相似系數(shù)0.76處最先獨(dú)立出來(lái)。山里紅在800bp、550bp和1200bp也存在3條特異性譜帶。此外。紫肉楂、白條紅、青條紅、冠金星等也存在不同的特異性譜帶，但是并非所有的品種都有這種現(xiàn)象。

3 討論

雖然RAPD分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用已很廣泛，但是國(guó)內(nèi)外將此技術(shù)應(yīng)用于山楂遺傳關(guān)系研究的極少。本研究的試驗(yàn)材料均采自山東臨沂市，并且在試驗(yàn)方法上與代紅艷等有所不同，比如在DNA提取中加入PVP和B—巰基乙醇，以更好地去除多糖和酚類物質(zhì)；在反應(yīng)體系上，本實(shí)驗(yàn)采用的RAPD-PCR擴(kuò)增的溫度、時(shí)間和引物的選擇上也有差別。并且本實(shí)驗(yàn)用試劑均來(lái)源于同一生物公司，保證了擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性。僅用15個(gè)引物，在20個(gè)山楂品種中擴(kuò)增出216個(gè)多態(tài)性譜帶，多態(tài)性比例高達(dá)81.9％。證明了利用RAPD分析完全能反映出山楂品種間的遺傳多樣性，可以作為山楂種質(zhì)分類鑒定的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)雖然所用引物數(shù)量不多。但能從216個(gè)位點(diǎn)對(duì)20個(gè)山楂品種進(jìn)行分子檢測(cè)，而且這種檢測(cè)效率比常規(guī)的生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征等方法更為可靠。本研究中多數(shù)山楂品種間表現(xiàn)出了豐富的遺傳多樣性，并且12個(gè)品種還有特異性DNA分子標(biāo)記，這些特異性條帶可能是某些優(yōu)良性狀基因，對(duì)于山楂品種間分子鑒定具有重要的參考價(jià)值，進(jìn)一步研究可以用于新品種的選育。

從聚類分析圖中可以看出，Ⅰ聚類組中第1部分有早面紅和大棉球，2者有較相似的生物學(xué)特性。果實(shí)較大且成熟早，果肉軟綿，果面布有果粉。野生品種花葉楂和山里紅同在Ⅱ聚類組中。這一研究和代紅艷等分析的結(jié)果相近。實(shí)生楂果實(shí)小而硬，枝刺較多。表現(xiàn)出較強(qiáng)的野生性狀可能屬于郭太君等提出的伏山楂品種群，其他的則為大果類山楂品種群，因此實(shí)生楂與其他山楂品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。