枯草芽孢桿菌防治果實采后病害的研究進展

摘要：果實采后病害嚴重影響水果的貯藏及果品質量。因化學殺菌劑在應用中存在危害人體健康及污染環境等一系列問題，利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)防治果實采后病害的生物防治手段作為一種有效替代方法受到人們的廣泛關注。枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性細菌研究的模式菌株，為重要的生防菌源。在探討枯草芽孢桿菌防治果實采后病害拮抗機制的基礎上，闡述了該領域的研究成果和最新進展，展示了枯草芽孢桿菌應用于果實采后病害生物防治的可行性和潛力，為今后果實采后生防產品的開發提供新的研究思路。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；采后病害；生物防治；作用機理

中圖分類號：S66

文獻標識碼：A

文章編號：1009—9980 (2009)05—699—05

一直以來，受果蔬產品貯藏和運輸周期所限制，新鮮水果采后損失現象經常發生。新鮮水果的品質惡化主要由病原菌引發，控制新鮮水果的采后病害往往是科研工作者的關注焦點。據報道，發達國家每年有10％～30％的新鮮水果損失于采后的腐爛，而在缺乏冷藏貯運設施的發展中國家，果實腐爛損失率則超過40％。引起果實采后腐爛的病原菌大多為真菌，長期以來防治真菌病害主要是采用化學殺菌劑，然而，由于病原菌的抗藥性、果品質量安全以及人們對環境保護的日益關注，發展無公害型生物農藥來控制果實采后病害成為一種新趨勢，逐漸成為研究熱點。自Gutter等首次證實枯草芽孢桿菌能夠拮抗柑橘果實病原菌的半個世紀以來，枯草芽孢桿菌作為一種有效的生防菌劑被廣泛應用于多種植物病原真菌的防治中。作者就近年來國內外關于枯草芽孢桿菌防治果實采后病害的研究情況進行綜述。以期為今后進一步促進果實采后病害生物防治技術的發展提供參考。

1 枯草芽孢桿菌概述

枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)為芽孢桿菌科(Bacillaceae)芽孢桿菌屬(BacillusCohn)中最具代表性的菌種，長期以來受到國內外研究學者的廣泛關注，這種內生芽孢的桿狀細菌也是研究革蘭氏陽性(Gram-positive，G⁺)細菌細胞生物學的模式菌株。枯草芽孢桿菌(B，subtilis)生理特征豐富多樣，在自然界中分布廣泛，該菌不僅可以在土壤、植物根際、體表等外界環境中生長，還是植物體內常見的內生細菌。這類細菌對人畜無毒無害。不污染環境，已廣泛應用于果實采后病害的生物防治研究中，屬于安全有益的微生物。譚志瓊等和王星云等先后證實枯草芽孢桿菌B68能夠通過產生抑菌物質有效控制香蕉果實炭疽菌及冠腐病菌的生長。趙白鴿等經試驗證實枯草芽孢桿菌B-903對蘋果輪紋菌具有明顯抑制效果，并有希望取代相當部分的化學農藥用于果樹病害防治。在南非部分地區，研究人員先后報道了枯草芽孢桿菌防治鱷梨采后病害的抗病機制，并將其活菌制劑噴灑于田間來防治鱷梨采后病害。利用廣譜抗生型枯草芽孢桿菌PRS5處理采后的蘋果和臍橙。可以達到良好防腐效果，相對防效分別高達86.7％和95.15％。辛玉成等通過室內及田間試驗證實了枯草芽孢桿菌XMl6菌株制劑和培養液均能有效控制蘋果霉心病的發生和危害。

鑒于枯草芽孢桿菌在果實采后病害防治方面的優勢，眾多的專家學者圍繞其拮抗機制展開了研究。

2 枯草芽孢桿菌作為生防因子的作用機理

關于拮抗型枯草芽孢桿菌的防病機制，近些年國內外學者進行了大量研究，認為其與病原菌間的作用方式主要包括拮抗作用、競爭作用和誘導寄主產生抗性等3方面。

2.1 拮抗作用

拮抗作用是指生防微生物通過同化作用產生抗菌物質來抑制有害病原物的生長，這也是生防細菌防治果實采后病害的主要機制。芽孢桿菌產生的拮抗物質主要有抗生素、細菌素、細胞壁降解酶類和其他抗菌蛋白及揮發性抗菌物質。其中，產生抗生素是枯草芽孢桿菌抗菌作用的一個重要因素。自1945年Johnson等報道枯草芽孢桿菌產生抗菌物質后，近半個多世紀以來，人們從枯草芽孢桿菌的不同菌株中發現了60多種抗生素。范青等分別報道了枯草芽孢桿菌B-912對桃和油桃褐腐病以及采后柑橘果實青、綠霉病的抑制效果，認為枯草芽孢桿菌的抑菌機理主要是通過產生抗菌素來抑制病菌的生長。枯草芽孢桿菌產生的脂肽類抗生素主要有表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(Iturins)和芬薺素(Fengycin)3大類。張靜等研究證實。從枯草芽孢桿菌PY-1發酵液中分離純化的伊枯草菌素A是PY-1有效防治柑橘采后綠霉病的主要抗菌物質。在防治采后蘋果炭疽病的研究中，檀根甲等證實了枯草芽孢桿菌B-24可以通過產生抗菌素發揮抑菌作用。Ongena等以B.subtilisM4為試材，研究該菌抑制蘋果采后灰霉病的抗性機理，認為M4主要是通過分泌脂肽類抗生索(Lipopeptides)，尤其是Fengycins來防治果實采后病害。齊東梅等研究證實了具廣譜拮抗作用的枯草芽孢桿菌H110主要通過分泌胞外抗菌蛋白來抑制蘋果梨采后青霉病和黑斑病的發生。枯草芽孢桿菌分泌的抗菌蛋白對多種病原真菌均具有明顯抑制作用，其抗病機制涉及抑制病原菌孢子產生和萌發，導致菌絲畸形，細胞壁溶解，原生質泄漏以至菌絲體崩潰等方面。

2.2 競爭作用

營養和空間位點的競爭作用是生防微生物發揮作用的重要機制之一。一般來說。病原菌主要是通過侵入果實表面的自然通道(皮孔、氣孔等)或機械傷口而引起果實采后病害發生。在防治鱷梨炭疽病的研究中，枯草芽孢桿菌可以通過在病原菌膠孢炭疽菌(Collectotrichumgleosporioides)附著孢周圍消耗營養，從而使病菌處于休眠狀態。齊東梅等在研究枯草芽孢桿菌H110防治蘋果梨采后病害過程中還發現，H11O除了通過產生抗菌蛋白實現抗菌目的外，還可能通過營養和空間位點競爭來抑制病原菌生長。另有研究認為，枯草芽孢桿菌QDH-1-1在防治采后蘋果青霉病的過程中，并不產生抗菌物質，主要是通過營養和空間位點競爭來控制病原菌的侵染，枯草芽孢桿菌B1O也是通過活菌液的營養競爭作用有效抑制灰霉病菌生長。由此作為草莓灰霉病的生防菌用于草莓采后的防腐保鮮。以往的研究證實，多數枯草芽孢桿菌的競爭作用只涉及生防細菌的種群數量和防效的相互關系，直接的遺傳證據和分子生物學研究不多見。

2.3 誘導抗性

采后果實抗病反應包括本身固有的抗病作用和誘導抗病2種方式。本身已有的抗病反應是由一些障礙物或已存在的生化反應來完成，包括組織木質化、產生植保素、以及過程中所涉及各種酶(PAL、PO、SOD、PPO等)的活性反應；誘導抗病反應因涉及果實對病原菌的識別、信號傳導以及相應基因表達等，非常復雜。當前，利用誘導抗性防治果實采后病害已開始為國內外研究人員所關注。應用研究表明，植物包括采后果實，預先經過一些生物型或非生物型誘導因子處理后，可產生抗病性，從而降低其發病率。作為一種生物型誘導因子，枯草芽孢桿菌誘導植物產生抗性作用的報道相對較少，但已經證明誘導植物抗性也是其生防作用的重要機制之一。

值得注意的是，枯草芽孢桿菌制劑抗生物質的作用，是整個菌體代謝物的綜合作用，而不是傳統應用中單一抗生物質的作用。

3 應用現狀

枯草芽孢桿菌具備多種優良特性以用于生防菌劑的研究開發與推廣應用，包括其在離體條件下可產生抗生素類、酶類和揮發性成分，可產生抗逆的芽孢，利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中存活、定殖與繁殖等。自Pusey等首次將枯草芽孢桿菌(B－3)菌系作為控制桃果實采后病害的生防制劑在美國取得專利后。枯草芽孢桿菌已廣泛應用于果實采后病害防治上，其中一些枯草芽孢桿菌工程菌株也被成功改良開發為商業生防菌劑，并進入產業化生產。大量實踐證明，枯草芽孢桿菌制劑的穩定性、與其他化學試劑的相容性和在不同果蔬不同年份防效的一致性等方面均明顯優于非芽孢桿菌和真菌生防菌劑。美國迄今已有4株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環保局(EPA)商品化或有限商品化生產應用許可。它們是GB03、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢桿菌變種(B，subtilisvar，amyloliquefaciensFZB24)。其中的生物殺菌劑QST713為AgraQuest公司產品，商品名為Serenade，主要用于防治水果采收前后病害。

我國利用芽孢桿菌防治植物病害的應用研究也有一定基礎，在田間病害生物防治研究中已成功開發并投入生產的商品化制劑有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等，但應用于果實采后防腐保鮮方面的枯草芽孢桿菌商品制劑并不多見。林開春等公布的含有枯草芽孢桿菌CCTCCM204085的防腐保鮮劑(公開號：1853489)在果實采后防腐保鮮方面的應用效果較好。楊佐忠等利用枯草芽孢桿菌PRS5處理采后的蘋果和臍橙，也達到了較好的防腐保鮮效果。

4 展望

隨著我國水果種植業的迅猛發展，果實采后防腐保鮮工作得到愈來愈多的重視，安全高效的生物防治手段也為廣大研究者所關注。實踐證明，相對于大田作物的生防措施，果實采后病害的生物防治具備獨特優勢，包括果實貯藏期的溫濕度可控制且穩定、浸果或噴霧方法可使拮抗菌準確進入作用位點、實驗室易于模擬果實貯藏條件，便于相關試驗的開展。此外，相對于經濟價值較高的水果產品，應用復雜的生防措施及較高的防治費用也易被接受。近年來，世界各國均在研究果實采后病害生物防治措施，包括適應果實采后系統的新途徑和方法。

現代生物學的發展極大地影響了微生物學的基礎理論研究和應用研究，隨著枯草芽孢桿菌全基因組序列測序工作的完成以及生物質譜技術的應用。枯草芽孢桿菌的蛋白質組學研究實現了真正意義上的突破。迄今為止，關于枯草芽孢桿菌防治水果采后病害相關分子機制方面的研究報道極少，應用差異蛋白質組學方法研究和確定病原菌誘導前后特異表達的功能蛋白，將為系統闡明枯草芽孢桿菌的抗病機制提供重要參考。

隨著人們環保意識的加強、生物防治理論的不斷深入以及現代生物技術的廣泛應用，枯草芽孢桿菌防治果實采后病害的研究開發展現出新的發展機遇，利用拮抗型枯草芽孢桿菌防治果實采后病害的生防技術將日趨完善。