采后玉露桃果實冷害發(fā)生與ＲＯＰ基因的表達調(diào)控

摘要：以軟溶質(zhì)玉露桃果實為材料，于8℃、5℃、0℃和LTC(8℃鍛煉3 d再轉(zhuǎn)到0℃貯藏)下貯藏30 d后轉(zhuǎn)至貨架(20℃)2d，對各個處理果實的腐爛和冷害程度、果實品質(zhì)變化規(guī)律以及ROP基因的表達模式進行了比較，以探討ROP基因與低溫脅迫的關(guān)系。結(jié)果表明，經(jīng)5℃和O℃貯藏30 d的玉露桃果實在貨架期間褐變加重，經(jīng)5℃處理的果實褐變最重，經(jīng)0℃處理果實表現(xiàn)后熟障礙；經(jīng)8℃貯藏30 d以及后續(xù)2 d貨架期的果實不出現(xiàn)冷害癥狀，但果實腐爛嚴重；LTC處理果實經(jīng)冷藏后在貨架期后熟正常，且果實冷害和腐爛均被明顯抑制。各處理桃果實在采后低溫貯藏過程中總可溶性糖和總有機酸質(zhì)量分數(shù)均趨下降，其中5℃處理果實總可溶性糖質(zhì)量分數(shù)下降幅度最大。結(jié)合應(yīng)用EST檢索和RT—PCR克隆擴增，分離出桃ROP基因(p_pROP)。實時定量PCR結(jié)果顯示，p_pROP在5℃下表達迅速增強，第5天達到高峰，其豐度明顯高于其他處理，LTC處理使p_pROP表達維持較低水平。

關(guān)鍵詞：玉露桃；果實；低溫脅迫；ROP基因表達

中圖分類號：S662.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1009—9980(2009)05—608—06

桃為我國第四大水果，年產(chǎn)量達800萬t。桃果實因其色、香、味俱佳，頗得消費者青睞。桃果實采收期正值高溫季節(jié)，采后果實迅速進入呼吸躍變期，成熟衰老進程較快，并伴隨果實軟化、風(fēng)味劣變和腐爛等現(xiàn)象。低溫貯藏可抑制桃果實軟化，延長貯藏壽命，但桃果實對低溫敏感，8℃以下溫度貯藏易導(dǎo)致冷害，表現(xiàn)為絮敗、褐變、不能正常后熟、失去固有風(fēng)味等癥狀，但8℃以上的溫度貯藏時果實軟化較快，南方軟溶質(zhì)桃(水蜜桃)尤為明顯。

為減輕低溫導(dǎo)致的冷害脅迫，可采取先在適宜的低溫下進行鍛煉后置于冷害溫度下貯藏的策略，稱為LTC(10w temperature conditioning)。我們在枇杷果實上應(yīng)用這一策略，顯著地抑制了冷害導(dǎo)致的果實木質(zhì)化和褐變。王貴禧等發(fā)現(xiàn)經(jīng)8℃下鍛煉9 d再轉(zhuǎn)到0℃貯藏，能減輕北方硬溶質(zhì)桃大久保果實貯藏冷害的發(fā)生。我們的前期工作表明，由于南方軟溶質(zhì)桃果實后熟軟化迅速，在8℃的鍛煉時間需要縮短。確定玉露桃的合適鍛煉時間為3 d(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

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在桃果實冷害發(fā)生機制方面，前人研究較多集中于細胞壁代謝酶活性及其基因表達分析，但對于果實如何對低溫信號作出響應(yīng)較少研究。近年來，作為植物多功能信號GTP結(jié)合蛋白之一的ROP蛋白(Rho-related protein from plants)在逆境防御中的作用受到廣泛關(guān)注。已有研究表明它介入了植物對病菌侵染、低氧、適度高溫和高鹽等脅迫的響應(yīng)。

我們針對軟溶質(zhì)玉露桃果實快速后熟軟化的特點，結(jié)合前期試驗結(jié)果，設(shè)計了8℃鍛煉3 d再轉(zhuǎn)到O℃貯藏的LTC處理，研究該處理對減輕果實冷害、控制腐爛和延緩采后果實品質(zhì)變化的效應(yīng)。同時，分析桃果實ROP基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)模式以及LTC對此響應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為玉露桃(Prunus persica L.cv.Yulu)，采自浙江省寧波市(奉化)。采后挑選大小均勻，成熟度一致(7，8成熟)，無病蟲害果實，于不同溫度下貯藏。處理為：(1)(8±0.5)℃；(2)(5±0.5)℃；(3)(0±0.5)℃；(4)LTC：(8±O.5)℃鍛煉3 d，再轉(zhuǎn)到(0±0.)℃貯藏。各個處理果實經(jīng)30 d貯藏后，轉(zhuǎn)至貨架(20℃)放置2 d。貯藏環(huán)境相對濕度為92％～98％。

1.2 方法

1.2.1 硬度測定 用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀(英國產(chǎn)，探頭直徑為7.9 mm)測定果實硬度。

1.2.2 腐爛率統(tǒng)計 選取50個果實檢查統(tǒng)計腐爛果數(shù)。計算果實腐爛率。

1.2.3 褐變指數(shù)分析 褐變指數(shù)統(tǒng)計參照文獻的方法進行。br>

1.2.4 可溶性糖和有機酸質(zhì)量分數(shù)分析 可溶性糖和有機酸的提取及質(zhì)量分數(shù)測定按文獻的方法進行。

1.2.5 桃果實ROP基因的克隆 分別以‘PeachROP’和‘Peach RAC’(RAC為ROP的舊稱)為關(guān)鍵詞從NCBI的EST庫中檢索桃ROP序列，通過與其他植物ROP基因序列的同源性比對進行鑒定，最后進行RT-PCR克隆擴增，序列拼接得到桃ROP基因片段。由其他植物ROP基因設(shè)計上游保守序列(5′-AGCAAGGCCAGCTATGAAAA-3′)，再根據(jù)已獲得的p_pROP片段序列設(shè)計特異下游引物(5′CTCTTTTGCTTCTTGGACT-3′)，用這對引物進行PCR使p_pROP序列向5′端延伸，再與原序列進行拼接。

1.2.6 實時定量PCR(Q-PCR) 參照文獻[18]的方法，設(shè)計并檢測特異性Q-PCR引物，內(nèi)參為p_p18SrRNA。引物序列見表1。

Q-PCR反應(yīng)體系及程序參照文獻[19]的方法，采用ＬLightCycler 1.2(Roche，德國)Q-PCR儀檢測。Q-PCR結(jié)果計算按文獻[19]的方法，設(shè)定基因在初始點(O d)的表達量為，命名為1。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 試驗采用完全隨機設(shè)計，結(jié)果用DPS軟件統(tǒng)計，用Origin 7.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃ROP基因的分離

經(jīng)EST檢索、序列拼接和RT-PCR克隆延伸，從桃果實中獲得1個ROP基因p_pROP(在DY651426序列的基礎(chǔ)上延伸了5′端序列。最終片段的開放閱讀框包括109個氨基酸)。經(jīng)與其他植物ROP序列進行比對，確定桃ROP與其他植物ROP具有相同的功能結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2 玉露桃果實采后貯藏冷害的發(fā)生及其調(diào)控措施

在采后貯藏過程中，玉露桃果實硬度下降明顯，且與貯藏溫度相關(guān)。8℃和5℃貯藏30 d果實的硬度均小于8N，果實已完全軟化。0℃和LTC處理可顯著延緩果實硬度下降，貯藏30 d時硬度分別為19.28N和10.94N。果實轉(zhuǎn)貨架2 d后，經(jīng)LTC處理的果實能正常后熟軟化，而經(jīng)0℃貯藏果實則維持較高硬度(2d和3d的硬度分別為12.09N和9.78N)，但存在后熟障礙(表2)。

果肉褐變是桃果實貯藏冷害的主要癥狀之一。不同溫度貯藏對果肉褐變的發(fā)生有不同影響。8℃貯藏時，無論在30d貯藏期間還是在2 d貨架期間均未出現(xiàn)組織褐變現(xiàn)象；5℃間貯藏30 d時果肉即發(fā)生嚴重褐變，轉(zhuǎn)入貨架期進一步加重；O℃貯藏30d時果肉僅有輕微褐變。但轉(zhuǎn)入貨架期間褐變迅速加重；LTC貯藏對果肉褐變有顯著抑制作用，貯藏30 d期間未發(fā)生褐變，并在2d貨架期間褐變輕微(表2)。

2.3 不同貯藏溫度下玉露桃果實采后品質(zhì)的變化

果實貯藏期間總可溶性糖和總有機酸質(zhì)量分數(shù)趨于下降。5℃處理果實的總可溶性糖質(zhì)量分數(shù)下降幅度最大，O℃次之；處理間總有機酸質(zhì)量分數(shù)變化差異不明顯(表3)。

8℃下貯藏時玉露桃果實能完全軟化，但腐爛嚴重；5℃下貯藏果實會發(fā)生冷害，褐變、腐爛嚴重，可溶性糖質(zhì)量分數(shù)迅速下降；O℃處理果實發(fā)生的冷害癥狀既包括褐變、可溶性糖質(zhì)量分數(shù)下降，也包括貨架期間的后熟(軟化)障礙；LTC處理既能顯著抑制玉露桃果實貯藏冷害發(fā)生，且后熟正常，并有效減少果實腐爛。

0～5℃貯藏玉露桃果實均出現(xiàn)冷害，但冷害程度和表型均有不同。0℃處理果實貯藏過程未出現(xiàn)冷害，冷害癥狀主要出現(xiàn)在貨架期間，并伴隨后熟軟化障礙；5℃處理果實的冷害癥狀在整個貯藏過程延續(xù)出現(xiàn)，因此，進一步從分子水平探討冷害機制時，冷害溫度選用5℃。對玉露桃果實正常貯藏溫度(8℃)、冷害溫度(5℃)和減輕冷害處理(LTC)這3種貯藏模式下的p_pROP表達開展了研究。

2.4 桃ROP基因的表達特性及不同處理效應(yīng)

應(yīng)用QPCR對p_pROP基因表達進行了分析。結(jié)果表明，p_pROP在果實貯藏前期表達增強，在5d達到峰值，隨后趨于下降。處理間相比，以5℃處理果實表達最強，8℃次之，而LTC處理最弱(圖2)。在貨架期間，LTC處理表達量上升，不同處理間有所區(qū)別。瞬時響應(yīng)試驗表明，p_pROP基因?qū)Φ蜏刭A藏敏感，表達增強的效應(yīng)在開始貯藏后1h內(nèi)發(fā)生，隨后加強，在12-24h內(nèi)達到穩(wěn)定，為初始表達強度的6倍左右(圖2中小圖)。

3 討論

前人研究表明。桃果實采后冷害的發(fā)生具中間溫度特性，即在5℃左右冷害最嚴重，本研究表明，玉露桃果實與其他桃品種有著類似的采后冷害癥狀和發(fā)生規(guī)律，其冷害特征突出表現(xiàn)為果肉褐變和O℃冷藏果實的不能正常后熟軟化。

由于玉露桃果實的采后快速軟化特性，8℃貯藏不能有效抑制果實軟化，同時也不能減少經(jīng)冷藏后轉(zhuǎn)入貨架期的果實腐爛。采用LTC處理既可顯著減輕冷害發(fā)生，又能減少果實腐爛率，為玉露桃果實采后貯運的有效手段。LTC處理減輕其他果實采后冷害的成功例子也見報道，但適宜的鍛煉溫度和時間因種類和品種而異。如硬溶質(zhì)大久保桃、枇杷、鱷梨和葡萄柚分別以8℃鍛煉9d、5℃鍛煉6d、6-8℃鍛煉3～5d、10～15℃鍛煉7d為宜。這些結(jié)果也暗示LTC作為果實采后冷害的控制措施具有普遍性。

ROP是植物多種脅迫信號傳遞的分子開關(guān)，在植物逆境響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。真菌侵染、缺氧、高溫和鹽脅迫均可誘導(dǎo)ROP基因表達增強。ROP通過與多種蛋白質(zhì)(酶)發(fā)生交互作用，誘導(dǎo)一系列脅迫響應(yīng)過程的發(fā)生。其中ROP活化NADPH氧化酶從而促進H202等活性氧的產(chǎn)生是ROP介導(dǎo)多種脅迫過程的重要機制，22-231。活性氧的積累可進一步誘導(dǎo)植物在應(yīng)對真菌侵染時發(fā)生細胞程序化死亡，在應(yīng)對缺氧時乙醇脫氫酶(ADH)活性上升。另一方面，ROP通過活化NADPH氧化酶促進活性氧的產(chǎn)生也是脅迫下植物傷害癥狀產(chǎn)生的重要原因。如在水稻懸浮細胞中過度表達組成型活化的水稻O_sRaci可導(dǎo)致細胞死亡，過度表達煙草NtROPl的擬南芥植株對鹽脅迫傷害的敏感性提高。在本研究中。我們觀察到冷害果實(5℃處理)中p_pROP基因表達顯著增強，減輕冷害的LTC處理可使P_pROP基因表達高峰推遲出現(xiàn)且維持較低水平(圖2)，這表明p_pROP可能參與了桃果實的冷響應(yīng)過程。p_pROP基因介導(dǎo)的冷害機制，是否與其他脅迫類似，即導(dǎo)致活性氧的積累，進而引致膜結(jié)構(gòu)破壞，促使酶促氧化反應(yīng)導(dǎo)致組織褐變，還有待進一步研究。

綜上所述。玉露桃果實采后貯藏中存在“中間敏感溫度”現(xiàn)象。5℃下貯藏最易罹冷害，發(fā)生組織褐變和果實腐爛；0℃貯藏雖可有效減少果實腐爛，但在貨架期仍出現(xiàn)組織褐變和后熟(軟化)障礙等冷害癥狀：8℃貯藏時不會發(fā)生冷害，但腐爛率高而不利貯藏；LTC處理既能顯著抑制玉露桃果實貯藏冷害發(fā)生，也可減少果實腐爛。且在貨架期間能正常后熟軟化，為玉露桃果實貯藏的適宜方式。基于不同處理果實中ROP基因表達模式，我們認為ROP參與了桃果實冷害的發(fā)生，LTC處理減輕采后桃果實冷害與該處理可抑制p_pROP基因表達相關(guān)，相關(guān)機制尚有待深入研究。