蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白的分解作用

摘要:通過瓊脂糖蛋白平板及水解度測定兩種方法從定性#65380;定量兩個方面研究了蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白的分解作用，同時測定并比較了蚯蚓豆粕反應物的氨基酸含量。結果表明，蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白具有一定的酶解活性，其水解度達2.75%。利用蚯蚓處理豆粕，反應物中多種氨基酸含量均有不同程度增加，氨基酸總量與豆粕相比上升了27.83%，而且各種必需氨基酸的比例也更趨合理。因此，利用蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白的分解作用可以有效地改善豆粕飼料的品質。

關鍵詞:蚯蚓;蛋白水解酶;大豆蛋白;豆粕;氨基酸

中圖分類號:TQ936.1 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0942-03

大豆餅粕蛋白質含量高，粗蛋白含量一般為35%~43%，且蛋白質品質好，賴氨酸含量高，氨基酸比較平衡，已成為全世界最主要的植物蛋白質飼料原料。大豆蛋白質多以貯藏體的形式存在，直徑在2~20 μm之間，分子量較大，約為8 000~600 000，其中分子量在100 000以上的約占80%。大豆蛋白水解后生成的肽和氨基酸易被動物體消化#65380;吸收，其營養特性和生理活性顯著提高，并且大豆肽還具有特殊的生物活性。

蚯蚓蛋白質含量很高，約占鮮重的8%~10%，干重的56%~66%，最高可達70%，且富含多種氨基酸。蚯蚓體內含有多種活性成分，消化道有10多種蛋白水解酶，這些蛋白酶類對蛋白質有較強的水解活性，利用蚯蚓自身水解酶分解蚯蚓蛋白質，可以得到較高營養價值的蚯蚓水解液，提取率一般在75%以上，其營養成分主要由18種氨基酸和少量短肽組成，其中氨基酸占85%，短肽和小分子蛋白質為14%~15%[1，2]。為了探索蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白的分解作用，試驗通過瓊脂糖蛋白平板法及水解度測定法從定性#65380;定量兩個方面研究了蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白的分解作用，并測定了蚯蚓與豆粕的反應產物中氨基酸的含量，為大豆蛋白與蚯蚓的開發利用提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料

蚯蚓:大平2號，由唐山師范學院蚯蚓養殖基地提供。豆粕:產地東北。主要儀器:NPCa-02型氮磷鈣測定儀，835-50型日立氨基酸分析儀。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂糖蛋白平板法

1)蚯蚓水解液的制備 取新鮮蚯蚓100 g，用自來水沖洗干凈，瀝干蚯蚓體表水分，把蚯蚓放入錐形瓶中，加蓋，置于50℃的恒溫箱中水解5 h，待蚯蚓水解為棕色液體時取出備用，或置于4℃冰箱中保存。

2)大豆蛋白的制備 取豆粕250 g粉碎，置于大燒杯中，加入蒸餾水1 250 mL(固液比1∶5);把大燒杯放入50℃的恒溫水浴鍋中，邊攪拌邊加入0.1 moL#8226;L-1 NaOH溶液，調節pH值至7.5~8.5之間，仍攪拌20 min，使大豆蛋白充分溶解在堿溶液中。以1 500 r#8226;min-1離心10 min，收集上清液，向上清液中逐滴加入1 moL#8226;L-1的鹽酸溶液，邊加鹽酸邊攪拌，調pH值至4.6~4.7時，靜置30 min。再以3 000 r#8226;min-1離心15 min，收集沉淀，加水中和，烘干備用。

3)瓊脂糖蛋白平板的制備 ①取大豆蛋白0.3 g溶于15mLpH值8.9的PBS緩沖液中，使蛋白含量為20 mg#8226;mL-1;②取pH值7.2的PBS溶液85 mL，加熱，快沸騰時，加入瓊脂糖0.425 g，使瓊脂糖濃度為5%，至瓊脂糖完全溶化時，停止加熱;③把pH值8.9的大豆蛋白溶液15 mL全部加入，攪拌均勻，趁熱倒入平板中，將氣泡趕至邊緣，室溫下凝固，共制備6皿，用直徑3 mm打孔器打孔，每皿3孔;④用滴管把蚯蚓水解液滴入孔內，加滿為止，然后放入50℃恒溫箱中;⑤分別在3 h#65380;4 h#65380;5 h#65380;6 h#65380;7 h#65380;8 h后取出平板，用考馬斯亮藍R250染液染色2 min，用7%冰乙酸脫色至能見到明顯的水解圈為止;⑥測量水解圈的直徑，并取平均值。

1.2.2 水解度(DH)的測定 取0.5 g大豆蛋白溶解在4.5 mL PBS緩沖液中，再加入0.5 mL蚯蚓水解液，在50℃恒溫箱中反應7 h后，作為待測樣品，用甲醛固定法測定樣品中氨基氮含量，同時扣除蚯蚓水解液和大豆蛋白溶液本身的游離氨基酸對水解度的影響，采用半微量滴定法測定樣品中的氮含量，最后計算出蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白的水解度[3-5]。

1.2.3 蚯蚓豆粕反應產物中氨基酸含量的測定 將豆粕粉碎，過80目篩后取豆粕粉1 000 g，與用組織勻漿機打碎的鮮蚯蚓勻漿液500 g放入搪瓷缸中，加蒸餾水適量攪拌混合至均勻糊狀，加蓋放入恒溫箱中，50℃反應5 h后，把反應產物取出移至搪瓷盤中攤薄，置于鼓風干燥箱中65℃下烘干，粉碎，測定其氨基酸的含量。

2 結果與分析

2.1 瓊脂糖蛋白平板法測定結果

在瓊脂糖蛋白平板的小孔周圍可見明顯的透明圈(表1)。由于考馬斯亮藍R250能通過范德華力與蛋白質特異結合，但不能與氨基酸結合。蚯蚓水解液中的蚯蚓蛋白水解酶可以分解小孔周圍的大豆蛋白，當蛋白質被分解成氨基酸，考馬斯亮藍會在冰乙酸的作用下被洗脫，而其他部分未能分解成氨基酸而不被脫色。因此，在小孔周圍可見明顯的透明圈，說明蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白具有分解作用，其分解反應的最佳時間應該在7 h左右。

2.2 水解度測定結果

由表2可知，待測樣品扣除蚯蚓水解液和大豆蛋白液中的氨基氮含量后，樣品中實際氨基氮含量為0.708 μmol#8226;mL-1，最后測得樣品中粗蛋白含量0.528 mg#8226;mL-1，經計算，蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白的水解度為2.75%。蚯蚓水解液與大豆蛋白反應7h后，大豆蛋白被蚯蚓蛋白水解酶分解，產生游離氨基酸，其水解度達2.75%，說明蚯蚓水解液中的蛋白水解酶對大豆蛋白具有較高的酶解活性。

2.3 蚯蚓豆粕反應產物中氨基酸含量

由表3可以看出，蚯蚓與豆粕反應后，反應物中氨基酸總量由豆粕的36.33 g#8226;100g-1上升到46.44 g#8226;100g-1，與豆粕相比上升了27.83%。其中反應物中除了絲氨酸#65380;甘氨酸#65380;組氨酸#65380;精氨酸的含量稍稍有所下降外，其余各種氨基酸含量都有不同程度的上升。由表4看出，蚯蚓豆粕反應物與豆粕相比，組氨酸#65380;異亮氨酸#65380;苯丙氨酸+酪氨酸#65380;纈氨酸#65380;精氨酸等幾種必需氨基酸與賴氨酸的比值均出現了下降，而更接近NRC(1998)豬的必需氨基酸營養需要量范圍。因此，利用蚯蚓處理豆粕，其反應物中氨基酸含量上升，各種必需氨基酸的比例也更趨于合理，豆粕的飼料品質得到有效改善，對提高豆粕的消化利用率及在畜牧業生產上的應用有著重要意義。

3 小結

蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白具有一定的酶解活性，其水解度達2.75%。利用蚯蚓處理豆粕，反應物中多種氨基酸含量均有不同程度增加，氨基酸總量比豆粕增加27.83%，而且各種必需氨基酸的比例也更趨合理。因此，利用蚯蚓蛋白水解酶對大豆蛋白的分解作用可以有效地改善豆粕的飼料品質。

參考文獻:

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[2] 蔡明才，艾 娜，張 梁，等.蚯蚓蛋白質的自溶與開發應用[J].生物學通報，2004，39(4):23-24.

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[4] 王秀奇，秦淑媛，高天慧，等.基礎生物化學實驗(第2版)[M].北京:高等教育出版社，1999.148-151.

[5] 何經緯，王之盛，曾有均.時間和溫度對酶水解豆粕效果的影響[J].飼料工業，2007，28(2):20-22.