中藥復方制劑連黃對沙門氏菌耐藥基因ａｐｈ（３′）－Ⅱａ ｍＲＮＡ表達水平的影響

摘要:通過研究中藥復方制劑連黃對沙門氏菌耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達水平的影響，從而深入探討連黃降低沙門氏菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性作用機理。采用競爭性RT-PCR法定量分析了連黃作用前后的沙門氏菌耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達水平。結果表明，連黃作用后的沙門氏菌耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達量降低，進而降低了沙門氏菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性。

關鍵詞:中藥復方制劑;沙門氏菌;aph(3′)-Ⅱa;競爭性RT-PCR;表達水平

中圖分類號:S853.9;S852.61+2;Q503 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0939-03

沙門氏菌病是一種常見的重要人畜共患腸道疾病，在世界各地的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占第1位或第2位[1，2]。抗生素的應用對控制和預防沙門氏菌病發揮了巨大的作用，然而隨著抗生素的濫用和不當使用，沙門氏菌的耐藥性日趨嚴重，尤其是耐氨基糖苷類藥物的沙門氏菌大量出現。本試驗采用競爭性RT-PCR法定量分析了中藥復方制劑連黃作用前后的沙門氏菌耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種 耐藥沙門氏菌04D917由韓國獸醫科學檢疫院提供，耐藥沙門氏菌D01#65380;R01#65380;R02由延邊大學農學院藥理實驗室提供。

1.1.2 試驗藥物 中藥復方制劑連黃由延邊大學農學院藥理室自制。

1.1.3 試驗試劑 TE緩沖液#65380;ExTaq DNA聚合酶#65380;dNTPs Mixture#65380;10× ExTaq Buffer(Mg2+plus)#65380;DL2000Marker#65380;瓊脂糖等為大連寶生物工程有限公司提供，otal RNA提取試劑盒#65380;TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver.3.0反轉錄試劑盒等為北京華美公司提供。

1.1.4 試驗器材 T1 PCR儀(德國Biometra公司)，GeIDoc-IT數字凝膠成像分析系統(美國SIM公司)，3-18k低溫高速離心機(武漢力博遠志科技有限公司)，HZQ-FX恒溫振蕩器(哈爾濱東明醫療儀器廠)，Y1-1450-1S無菌超凈工作臺(濟南天方凈化設備工程公司)，U-1800紫外分光光度計(SIGMA公司)，UV-722可見光分光光度計(上海亞研電子科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 競爭性RT-PCR內標和外標的建立 ①模板DNA的提取，參照莫嵐等的方法[3]，稍作改進后進行(提取中藥復方制劑連黃作用前的耐藥沙門氏菌D01#65380;04D917#65380;R01#65380;R02的染色體DNA)。②引物的設計與合成，根據GenBank[4]中登錄號為AJ601386的沙門氏菌的耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的序列和試驗耐藥菌株D01測序所得的aph(3′)-Ⅱa耐藥基因的序列結果，用Oligo 6.0和Primer 5.0軟件在保守區內設計合成擴增aph(3′)-Ⅱa基因內標和外標所需的3個引物aA1，aA2，aA3。引物序列分別為:aA1:5’ CAG GTG CGA CAA TCT ATC 3’; aA2:5’ ATC CTG GTA TCG GTC TGC CTG AGC GAG ACG AAA TAC 3’;aA3:5’ ATC CTG GTA TCG GTC TGC 3’。其中引物aA1和aA2擴增的aph(3′)-Ⅱa耐藥基因片段為內標，長度為336bp;引物aA1和aA3擴增的aph(3′)-Ⅱa耐藥基因片段為外標，長度為577 bp，由上海英駿生物技術公司合成，-20℃保存備用。③ 內標和外標的PCR擴增體系，擴增反應總體積為25 μL，其中滅菌dd H2O 18.25 μL#65380;10×ExTaq Buffer(Mg2+plus) 2.5 μL#65380;dNTPs Mixture(2.5 mmol#8226;L-1)2.0 μL#65380;DNA模版1μL#65380;引物(aA1，20 μmol#8226;L-1)0.5 μL#65380;引物(aA2，aA3，20 μmol#8226;L-1)0.5 μL#65380;ExTaq DNA聚合酶(5U#8226;μL-1)0.25 μL。置PCR儀上進行自動擴增反應，循環參數為95℃熱啟動10 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行30個循環，最后于72℃溫育10 min。產物10 μL經1.5%瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳30 min。大量回收內標和外標片段，采用無菌去離子水調整至內標和外標單位濃度拷貝數(copies#8226;μL-1)相等[5]。

1.2.2 競爭性RT-PCR標準曲線的制備 將外標模板進行10倍梯度系列稀釋[5]，制備成1×1010copies#8226;μL-1#65380;1×109copies#8226;μL-1#65380;1×108copies#8226;μL-1#65380;1×107copies#8226;μL-1#65380;1×106copies#8226;μL-1#65380;1×105copies#8226;μL-1#65380;

1×104copies#8226;μL-1#65380;1×103copies#8226;μL-1和1×102copies#8226;μL-1，-20℃保存備用。將等量的內標與梯度稀釋的外標采用引物aA1和aA3共擴增。PCR反應體系如下，擴增反應總體積為25 μL，其中滅菌dd H2O 17.25 μL#65380;10×ExTaq Buffer(Mg2+plus) 2.5 μL#65380;dNTPs Mixture (2.5 mmol#8226;L-1)2.0 μL#65380;內標1 μL#65380;外標(10倍梯度系列稀釋)1 μL#65380;引物(aA1，20 pmol#8226;μL-1)0.5 μL#65380;引物(aA2，aA3，20 pmol#8226;μL-1) 0.5 μL#65380;ExTaq DNA聚合酶(5 U#8226;μL-1)0.25 μL。置PCR儀上進行自動擴增反應，循環參數為95℃熱啟動10 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行30個循環，最后于72℃溫育10 min。

1.2.3 中藥復方制劑連黃作用前后aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達水平的定量檢測 ①中藥復方制劑連黃作用后各aph(3′)-Ⅱa總RNA的提取根據Total RNA提取試劑盒說明書操作。②中藥復方制劑連黃作用后各aph(3′)-Ⅱa總RNA的反轉錄產物制備根據TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver.3.0反轉錄試劑盒說明書操作。③反轉錄產物與內標共擴增PCR反應體系，擴增反應總體積為50 μL，其中滅菌ddH2O 27.75 μL#65380;5×PCR Buffer10 μL#65380;反轉錄產物cDNA 10 μL#65380;內標1 μL#65380;引物(aA1，20 μmol#8226;L-1)0.5 μL#65380;引物aA3，20 μmol#8226;L-1)0.5 μL#65380;ExTaq DNA聚合酶(5 U#8226;μL-1)0.25 μL。置PCR儀上進行自動擴增反應，循環參數為95℃熱啟動10 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸90 s，進行30個循環，最后于72℃溫育10 min。④中藥復方制劑連黃作用前后aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達電泳分析。⑤中藥復方制劑連黃作用前后aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達量的比較分析，參照劉芳萍等的方法[6]，稍作改進后進行。

2 結果與分析

2.1 競爭性RT-PCR標準曲線的制備

2.1.1 內標模板和外標模板的定量 對內標和外標PCR擴增產物純化，純化后進行定量，無菌去離子水稀釋，使內標模板和外標模板的單位濃度拷貝數均為1×1011copies#8226;μL-1，-20℃保存備用。

2.1.2 標準曲線制備的電泳分析結果 采用瓊脂糖凝膠電泳法，以DL2000 DNA Marker為標準，PCR產物5 μL經1.5%瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳30 min，使用凝膠成像儀觀察結果并拍照。結果見圖1。由圖1可見，隨著外標拷貝數的梯度增加，以外標為模板的PCR產物的條帶亮度明顯增加，而以內標為模板的PCR產物的條帶亮度明顯降低。

2.1.3 標準曲線制備的圖像分析結果 采用SDS 2.1數字凝膠成像分析系統對電泳條帶進行灰度掃描，得到標準曲線，結果見圖2。其回歸方程和相關系數分別為:1.496 2x-2.287 7，r=0.932 7。

2.2 中藥復方制劑連黃作用前后aph(3′)-Ⅱa的 mRNA表達水平的定量結果

2.2.1 中藥復方制劑連黃作用前后aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達電泳分析 結果見圖3。由圖3可見，Marker左邊為中藥作用前耐藥沙門氏菌的aph(3′)-Ⅱa的mRNA的表達電泳條帶，Marker右邊為中藥作用后耐藥沙門氏菌的aph(3′)-Ⅱa的mRNA的表達電泳條帶。中藥作用前(3~6)耐藥沙門氏菌的aph(3′)-Ⅱa的mRNA的表達電泳條帶中，以內標為模板的PCR產物的條帶亮度均明顯地低于以耐藥菌株反轉錄產物cDNA為模板的PCR產物的條帶亮度;而中藥作用后(7~10)耐藥沙門氏菌的aph(3′)-Ⅱa的mRNA的表達電泳條帶中，以內標為模板的PCR產物的條帶亮度均明顯地高于以耐藥菌株反轉錄產物cDNA為模板的PCR產物的條帶亮度。

2.2.2 中藥復方制劑連黃作用前后aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達量的比較分析 根據各cDNA樣本的lg577bp/336bp值在標準曲線上求出其相應的外標DNA量。結果見表1。由表1可知，中藥復方制劑連黃作用后的耐藥沙門氏菌菌株D01(后)#65380;04D917(后)#65380;R01(后)和R02(后)的aph(3′)-Ⅱa mRNA的表達量與相應的中藥復方制劑連黃作用前菌株比較，均發生了不同程度的降低。其中誘導耐藥株D01(后)的aph(3′)-Ⅱa的mRNA的表達水平降低幅度較大。

3 小結與討論

1)本研究采用RT-PCR技術對中藥復方制劑連黃作用前后沙門氏菌耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達量的變化進行了分析。雖然此法只能測定mRNA的相對含量，但在比較中藥復方制劑連黃作用前后樣品之間特異mRNA的表達差異時足以說明問題。與經典的檢測基因的表達方法如Northern印跡#65380;RNA酶保護分析等相比，競爭性定量RT-PCR法以其靈敏度高#65380;專一性好#65380;快速簡便#65380;且對初始總RNA量要求不很嚴格等諸多優點而得到廣泛應用[7]。

2)本試驗結果表明，在RT-PCR標準曲線制備過程的共擴增體系中，當內標和外標模版的加入量相等時，兩個電泳條帶的亮度一致，說明引物設計合理，使內標模版和外標模版在同一體系中實現了對引物#65380;dNTP等各反應成分的競爭，從而使產物條帶的亮度與模板量呈正相關;而且兩種產物條帶大小相差適宜，在1.5%瓊脂糖凝膠中可有效分離。由此可見該競爭定量RT-PCR反應體系適當，可以作為討論基因轉錄水平的有效手段。

3)本研究通過對中藥復方制劑連黃作用前后各沙門氏菌耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達量進行比較分析可知，中藥復方制劑連黃作用后(7~10)，耐藥沙門氏菌的aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達量均低于其相應的中藥作用前(3~6)耐藥沙門氏菌的aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達量。由此可知，中藥復方制劑連黃對沙門氏菌耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的表達過程有一定的影響，可能使反轉錄酶的特異性發生了改變;亦可能破壞了RNA模板的完整性，使RNA模板容易形成二級結構，從而影響了反轉錄特異性產物的擴增[8]，導致耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達量減少，進而降低了沙門氏菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性。但其具體的作用機制還有待于深入研究。

4)采用競爭性RT-PCR技術可有效地對中藥復方制劑連黃作用前后各沙門氏菌耐藥基因aph(3′)-Ⅱa的mRNA表達水平進行定量檢測，同時對研究該耐藥基因mRNA的表達水平與沙門氏菌耐氨基糖苷類藥物的表型之間的關系提供了理論依據[9]。

參考文獻:

[1] CHARLES M，DOZOIS S，POURBAKHSH A，et a1. Expression of pand type l (F1) fimbriae in pathogenic Escherichia coli from poultry [J]. Vet Microbiol，1995，45(4):297-309.

[2] 高 崧，滕 峰，蘆銀華，等.16省市區禽源性大腸桿菌O18和078的外膜蛋白型[J]. 江蘇農業科學，1999，20(2):5-9.

[3] 莫 嵐，王其南. 聚合酶鏈式反應快速檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J]. 中華內科雜志，1998，37(2):99-102.

[4] 胡奇林，林鋒強，陳少鶯，等.應用RT-PCR技術檢測番鴨呼腸弧病毒[J].中國獸醫學報， 2004，24(3):231-232.

[5] 陳愛美， 陳儀本. 競爭性RT-PCR法及大腸桿菌acrA基因mRNA表達水平的定量研究[J]. 微生物學報，2007，47(2):235-239.

[6] 劉芳萍，佟恒敏.RT-PCR法定量分析沙門氏菌中acrA基因mRNA的表達[J].毒理學雜志，2005，19(3):304.

[7] 黃留玉，王恒墚，蘇國富，等. PCR最新技術原理#65380;方法及應用[M]. 北京:化學工業出版社， 2005.

[8] 邢永娜，盧大儒. 影響反轉錄過程多種因素的探討[J].細胞生物學雜志，1998，20(1):38-41.

[9] 李 楊，鞠玉琳，王曉波，等. 中藥“連黃”對耐藥沙門氏菌抑制作用的研究[J].吉林畜牧獸醫，2007(110):38-39.