產堿性纖維素酶真菌的篩選鑒定及酶學性質研究

摘要:經過初篩和復篩從從堿性土樣中分離出的7株產纖維素酶的真菌中獲得1株能夠產堿性纖維素酶的絲狀真菌t42。經18S rRNA基因序列分析和，確定該菌株為鐮刀霉菌(Fusarium sp)。酶學性質初步研究顯示t42的CMC酶最適作用pH值為7.5，在pH值7.0~8.5的范圍內具較高的穩定性;反應溫度以50℃左右為宜，且在55℃以下具有較高的溫度穩定性;Mg2+#65380;Mn2+和Zn2+對酶反應有促進作用，Pb2+和Cu2+對酶反應有抑制作用。

關鍵詞:堿性纖維素酶;真菌;篩選鑒定;酶學性質

中圖分類號: 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0899-02

纖維素酶是由多種水解酶組成的一個復雜酶系，主要來自于真菌和細菌。堿性纖維素酶在堿性條件下具有內切β-1，4葡萄糖苷酶活力，因而在洗滌劑#65380;紡織#65380;廢水處理和制漿造紙工業等行業中有更好的應用前景[1-3]。但目前研究較多的是木霉(Trichoderma)#65380;曲霉(Aspergillus)屬等真菌產生的酸性纖維素酶。酸性纖維素酶在堿性條件下酶活性較低或根本沒有活性#65380;穩定性較差#65380;pH值適應范圍窄等，這極大限制了纖維素酶在這些行業中的應用。因此篩選產酶性能好的產堿性纖維素酶的菌株有較大的實際意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

堿性土壤#65380;朽木取自湖北咸寧天化紡業有限公司附近。羧甲基纖維素鈉培養基(CMC-Na培養

基)[4]:NaCl 6 g，MgSO4#8226;7 H2O 0.1 g，KH2PO4 0.5 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 2.0 g，CMC-Na 15 g，(NH4)2SO4 2.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值8~8.5;固體培養基加1.5%瓊脂。分離培養基(PDA培養基):馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

1)固體培養初篩 將采集到的堿性土壤#65380;朽木等經無菌水洗滌后，吸取上清液作一系列梯度稀釋，將稀釋液涂布在選擇培養基——羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板上(用前加入適量抗生素來抑制細菌生長)，28℃倒置恒溫培養;分離篩選生長旺盛，并在剛果紅染色#65380;NaCl脫色后可以觀察到菌落周圍有明顯透明水解圈的菌株進行下一步研究[5]。

2)搖瓶復篩 將篩選到的菌種由平板接到50 mL(250 mL三角瓶)液體培養基中，于28℃#65380;210 r#8226;min-1下培養24 h，制成種子液。然后按5%的接種量將種子液加到50 mL(250 mL三角瓶)相應液體培養基中，于28℃#65380;210 r#8226;min-1條件下培養48 h，將發酵的粗酶液在不同pH條件下測定酶活，選擇酶活反應的最適pH偏堿性的菌株保藏備用。

1.2.2 纖維素酶活力的測定 取1.5 mL 0.05 mol#8226;L-1醋酸緩沖液配制的1.0%羧甲基纖維素鈉溶液，加入0.1 mL經5 000 r#8226;min-1離心10 min所得的發酵液上清液，50℃反應20 min。用DNS法測定反應后還原糖(葡萄糖)含量，做空白對照扣除本底。酶活定義為上述條件下，1 mL發酵液1 min催化底物生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位“IU”。

1.2.3 菌種鑒定 采用18S rRNA基因分析[5-7]:提取絲狀真菌的DNA，用真菌核糖體DNA轉錄間隔區(ITS)通用引物(5′—TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC—3′和5′—GGA GAT AGT CGT AAC AAG G—3′)進行PCR 擴增，擴增產物純化后經北京三博志遠生物技術有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選鑒定

取自堿性土壤#65380;朽木的23份樣本中經稀釋涂布平板分離到能在pH值7.0~8.0的CMC-Na平板上生長的透明圈直徑較大的真菌7株。搖瓶復篩，其中1株初始編號為t42的菌株在堿性條件下生長較快，最適酶反應pH值(內切酶活力在pH值7.5左右達最高)及菌株生長的耐堿性都要高于其他產纖維素酶的真菌(表1)，因而選用此菌株作進一步的研究。該菌株經北京三博志遠生物技術有限公司測序，初步確定該菌株為鐮刀霉菌(Fusarium sp)。

2.2 酶學性質的初步研究

2.2.1 酶反應的最適pH值 將t42的CMC酶液分別置于pH值5.5#65380;6.0#65380;6.5#65380;7.0#65380;7.5#65380;8.0#65380;8.5#65380;9.0#65380;9.5的HAC-NaAC緩沖液中測定CMC酶活力(圖1)。結果表明，酶反應的最適pH值為7.5左右，且在pH值8.5也具有較高的酶活性。

2.2.2 酶的pH穩定性 將t42的CMC酶液分別置于不同pH值的HAC-NaAC緩沖液中，室溫保持1 h后，按常規方法測定剩余酶活力(圖2)，結果顯示，t42的酶液在pH值7.0~8.5范圍內，剩余酶活力可保持80%以上。

2.2.3 酶反應的最適溫度 取t42的CMC酶液置于pH值7.5的HAC-NaAC緩沖液中，分別在30℃#65380;35℃#65380;40℃#65380;45℃#65380;50℃#65380;55℃#65380;60℃#65380;65℃#65380;70℃#65380;75℃#65380;80℃的溫度條件下反應，測定酶活力(圖3)。結果表明，該酶的最適反應溫度為50℃，在40~55℃間具有相對較高的酶活力。

2.2.4 酶的熱穩定性 將t42的CMC酶液在30℃#65380;35℃#65380;40℃#65380;45℃#65380;50℃#65380;55℃#65380;60℃#65380;65℃#65380;70℃#65380;75℃#65380;80℃各溫度下保溫1h后，按常規方法測定剩余酶活力(圖4)，結果表明，該酶在經30~55℃溫度范圍內，酶活性可保持原活力的80%以上。說明該酶在55℃以下的具有較高的溫度穩定性。

2.2.5 金屬離子對酶活性的影響 在酶反應體系中加入不同的金屬離子(0.01 mol#8226;L-1)，測定CMC酶活力(圖5)，結果顯示，Mg2+#65380;Mn2+和Zn2+對酶反應有促進作用，Pb2+和Cu2+對酶反應有抑制作用。

3 小結

從堿性土壤樣品中篩選到1株能夠產堿性纖維素酶的絲狀真菌菌株t42，經18S rRNA基因分析，初步確定該菌株為鐮刀霉菌(Fusarium sp)。研究t42的粗酶液的CMC酶的酶學性質表明，其最適作用pH分別為7.5，在pH7~8.5的范圍內具較高的穩定性;反應溫度以50℃左右為宜，且在50℃以下具有較高的溫度穩定性。Mg2+#65380;Mn2+和Zn2+對酶反應有促進作用，Pb2+和Cu2+對酶反應有抑制作用。該菌株產酶活力高#65380;穩定性好，具較強的耐堿性。這些特性還未見報道，因而在洗滌劑#65380;紡織#65380;廢水處理和制漿造紙工業等行業中有較好的應用前景。

參考文獻:

[1] ZHANG Y， HIMMEL M， MIELENZ J. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies[J]. Biotechnology Advances 2006，24:452-481.

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[5] 薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南[M].第3版.黃培堂，譯.北京:科學出版社，2002

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