寧強矮馬微衛星遺傳多樣性研究

摘要:采用8個微衛星標記對12匹寧強矮馬的遺傳多樣性進行了分析，結果表明，在6個微衛星位點上存在遺傳多態性，COR059有8個等位基因，ICA40有5個等位基因，AHT040有8個等位基因，UM016有9個等位基因，UM002有6個等位基因，TKY21有5個等位基因，各位點平均有效等位基因數4.93#65380;平均多肽信息含量為0.743#65380;平均雜合度0.78，數據表明寧強矮馬保持了較為純凈的原始基因庫，對寧強矮馬這一瀕危物種進行資源評價#65380;保護和開發利用研究提供了分子水平的理論依據。

關鍵詞:寧強矮馬;微衛星標記;遺傳多樣性

中圖分類號:S821;Q503;S813.3 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0868-03

寧強馬(Ningqiang horse)是陜西地方品種，屬西南馬種，相傳是春秋戰國以前古羌人從青海游牧地南下，進入寧強時遺留下來的馬種。其以體質緊湊結實#65380;耐艱苦#65380;體形輕小#65380;適應山區自然條件等為特征，主要產區在嘉陵江及漢水流域的廣坪，陽平關及代家壩等地區，分布在海拔950~1 000 m的淺山丘陵地區[1]。寧強馬品種中存在一種低于106 cm的矮馬群體，被稱為寧強矮馬(Ningqiang pony)，它是瀕臨絕跡的我國珍稀矮馬品種。

中國矮馬，史稱果下馬，分布面積廣，歷史悠久，早在兩千多年前，我國就有關于它的記載。目前我國發現的矮馬品種按產地劃分，主要有廣西德保矮馬#65380;四川安寧果下馬#65380;貴州矮馬#65380;云南馬關矮馬#65380;陜西寧強矮馬等。中國矮馬由于是長期閉鎖繁育形成的，保持了較為純凈的原始基因庫，科研價值極高[2]。寧強矮馬作為一個固有的，瀕臨滅絕的珍稀物種，受到國家和科學工作者的高度重視，但目前僅限于形態學#65380;育種學方面的研究，李金蓮等也僅研究了蒙古馬和英純血的微衛星遺傳多樣性[3]。本研究采用微衛星標記技術，在分子水平上探討寧強矮馬的遺傳多態性，為寧強矮馬的起源進化研究和科學評價其遺傳資源價值#65380;保護和開發利用提供分子水平的科學依據。

1材料與方法

1.1DNA提取

在陜西省漢中市寧強縣用簡單隨機抽樣法采集12匹寧強矮馬的血樣，加ACD抗凝，放入-72℃超低溫冰箱保存。根據文獻[4]提供的技術，采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，4℃保存，備用。

1.2PCR擴增反應體系及程序

PCR反應總體系為12 μL，10×PCR緩沖液1.2 μL，MgCl2(25 mmol)1.2 μL，dNTP(25 mmol)0.75 μL，上下游引物(10 pmol)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(0.5 U#8226;μL-1)1 μL，DNA模板(50 ng#8226;μL-1)0.5 μL，超純水6.05 μL。

PCR擴增條件如下:先94℃預變性2 min， 94℃變性30 s，X℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環，然后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3引物序列

根據Barker[5]微衛星選擇標準及相關文獻所提供的馬的微衛星引物序列[6-9]選擇引物序列，引物合成由上海生物工程公司完成。

1.4統計方法

所有位點觀察得到的等位基因數#65380;有效等位基因數#65380;雜合度#65380;熵值通過POPGENE軟件計算，多態信息含量由以下的公式獲得[10]:

pi和pj分別為第i和j個等位基因在群體中的頻率，m為等位基因數。

2結果與分析

2.1DNA的檢測

提取的基因組DNA，用紫外分光光度法檢測其純度，計算OD260與OD280之比值，本研究所提DNA的比值均在1.78左右，并將基因組DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。

2.2微衛星PCR擴增產物的檢測

PCR產物先經瓊脂糖凝膠檢測，對經瓊脂糖凝膠檢測效果好的PCR產物利用0.8%聚丙烯酰胺凝膠進行進一步的檢測分析，結果見圖2。

2.3微衛星多態性評價

采用8個微衛星位點對寧強矮馬的遺傳多樣性進行分析，發現寧強矮馬在6個微衛星位點具有較豐富的多態性。其中在COR059位點上檢測到8個等位基因，片段大小為261~313bp;在ICA40位點上檢測到5個等位基因，片段大小為255~272bp;在AHT040位點上檢測到8個等位基因，片段大小為228~43bp;在UM016位點上檢測到9個等位基因，片段大小為171~196bp;在UM002位點上檢測到6個等位基因，片段大小為200~245bp;在TKY21位點上檢測到5個等位基因，片段大小為209~230bp。這一結果表明，寧強矮馬在同一位點上的基因型和基因型頻率有所差異，說明寧強矮馬群體的遺傳特征非常豐富，選育的空間較大。

通過POPGENE軟件計算寧強矮馬在這6個位點上的遺傳信息，得到(表2)觀察等位基因數位為5~9，有效等位基因數最高的為6.26，最低的為3.10，平均有效等位基因數為4.93;寧強矮馬在各位點均表現較高的雜合度，平均雜合度為0.78，說明寧強矮馬的雜合程度較高，遺傳變異較大;多態信息含量最低都為0.67，平均多態信息含量為0.743，遠遠大于0.5;除UM002以外，其余位點的熵值均在1.0以上，絕大多數超過1.0，最高的為1.559 6，平均熵值為1.225 7。

3討論

3.1等位基因問題

從進化的角度看，群體中的等位基因組成是長期進化的產物，群體中的遺傳多態性也是歷史的產物。根據全球家畜品種間遺傳距離測定草案中提出的微衛星選擇標準:每個微衛星位點至少應有4個等位基因方能較好的應用于遺傳多樣性的評估。本研究的寧強矮馬在6個位點上共檢測到41個等位基因。每個位點的等位基因數均在4個以上，說明這6個位點都可用于寧強矮馬的遺傳多態性評價。有效等位基因數是基因純合度的倒數，有效等位基因數比實際觀察到的要少，表明等位基因間相互影響。如果等位基因在群體中分布越均勻，有效等位基因就越接近實際檢測到的等位基因的絕對數。從表2可看出，寧強矮馬在6個位點上有效等位基因數為3.10~6.25個，平均有效等位基因數為4.93個。雖然試驗中有效等位基因數和實際檢測到的等位基因數存在一些差距，但這是因為等位基因頻率的分布有高有低#65380;分布不均勻所造成的，針對這一現象應該擴大樣本量深入研究。

3.2雜合度分析

雜合度又稱為基因多樣度，反映群體在多個基因座上的遺傳變異。一般認為它是度量群體遺傳變異的一個最適參數[11]。群體雜合度的計算是先得到每個基因座位為雜合子的頻率，然后除以基因總數得到平均頻率;雜合性要估計得可靠，必須建立在大于4個基因座位樣本的基礎上。本試驗的6個微衛星位點的雜合度都在0.6以上，平均雜合度為0.78，說明寧強矮馬近交程度低，遺傳多樣性豐富，進一步選育的空間較大。

3.3多態信息含量

多態信息含量是衡量片段多態性的一個指標。Botstein等提出了衡量基因變異程度高低的多態信息含量指標，當PIC>0.5時，該基因座為高度多態基因座;0.25

本次試驗采用微衛星標記技術在分子水平對寧強矮馬的遺傳多樣性進行探討，所選的微衛星位點的平均熵值為1.225 7，說明寧強矮馬種群在核基因水平仍然保持著豐富的遺傳多樣性。寧強矮馬是一個古老的品種，長期閉鎖繁育，沒有受到外來物種的沖擊，其遺傳資源得到了很好的保護，保持了較為純凈的原始的基因庫，遺傳多樣性豐富，這對于我國馬種多樣性的研究和保護具有極大的科學意義。

參考文獻:

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[3]李金蓮，芒來，石有斐. 利用微衛星標記蒙古馬和純血馬遺傳多態性的研究[J]. 畜牧獸醫學報，2005，36(1):6-9.

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