扁桃品種的ＳＳＲ分析

摘要:利用SSR方法對16個扁桃品種#65380;1個榆葉梅品種和1個晚熟毛桃進行了基因組多態性分析，從15對引物中篩選出12對多態性#65380;穩定性較好的引物用于正式試驗，12對引物在18個供試品種中共擴增出80條DNA譜帶，平均每對引物擴增出5~6條，用W0622106#65380;W0622114#65380;W0622094#65380;W0622116等4對引物可以鑒別18個供試品種中的17個品種，根據SSR分析結果，應用NTSYS軟件進行相似性系數計算，利用UPGMA法構建聚類樹狀圖。供試扁桃品種可分為5個類群，與傳統的系譜有一定的誤差。

關鍵詞:扁桃;SSR;聚類分析

中圖分類號:S662.9;Q503 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0865-03

扁桃(Amygdalus communis L.)是世界上優良的木本油料樹種和四大干果之首，系薔薇科桃屬植物。扁桃資源主要分布在中國#65380;俄羅斯#65380;美國#65380;西班牙#65380;意大利#65380;葡萄牙#65380;法國#65380;土耳其#65380;伊朗等國家，世界上共有53個種(變種)。我國扁桃主要分布在新疆的準葛爾西部山地#65380;阿爾泰山，內蒙古的烏拉山#65380;大青山，寧夏的賀蘭山以及青藏高原的東部，共有6個種。而新疆主要分布在喀什地區的英吉莎#65380;莎車等縣，約有近百個品種。我國栽培普通扁桃已有

1 300多年的歷史，由于長期的人為影響，實生品種#65380;品系#65380;優良單株以及野生#65380;半野生資源可達250多個[1，2]，這些資源形態各異，關系復雜，多數品種譜系不清，同名異物或同物異名的現象十分普遍，這就給扁桃的分類#65380;栽培以及品種選育帶來很大困難。國外在普通扁桃的雜交育種#65380;同工酶分析#65380;化學分類和分子標記等方面做了較多的工作，但我國對扁桃遺傳資源的系統性研究還很少，多數品種還停留在表型鑒定水平[3]。本研究對新疆的扁桃資源及相近屬#65380;種進行了SSR分子標記和聚類分析，旨在探討新疆南疆地區扁桃各個品種以及相關屬之間的親緣關系，以期為我國扁桃資源的遺傳連鎖圖譜的構建#65380;基因分離以及分子雜交育種和分類奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用的16個扁桃品種(Amygdalus communis L)均取自新疆莎車縣托木吾斯唐鄉5村扁桃品種園，榆葉梅和晚熟毛桃在本校實驗農場采集，具體見表1，取健康植株一年生枝條上剛展開的嫩葉，置于-70℃待用。SSR引物按T. Joobeur[4]#65380;Yong Xu[5]等報道的序列，由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成，其他供試藥品均由該單位提供。由15對引物篩選出12對多態性#65380;穩定性較好的引物進行正式試驗。

1.2試驗方法

1.2.1DNA的提取與分離參照吳樹敬等[6]的方法提取基因組DNA，紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質量，稀釋至所需質量濃度后，置-20℃保存備用。

1.2.2PCR擴增SSR反應體系經優化，確定引物最佳退火溫度大部分在50~60℃，比Tm/2值要高2~5℃，Taq DNA聚合酶和DNA最適用量分別為1U和100ng，Mg2+#65380;dNTP和引物最適終濃度分別為1.5 mmol#8226;L-1#65380;0.2 mmol#8226;L-1和0.2 μmol#8226;L-1，反應總體積為20 μL。反應程序為94℃預變性4 min，94℃變性45 s，50~60℃變性45 s，72℃延伸1 min，共循環35次，72℃延伸5 min，終止。擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測。

1.2.3數據統計電泳圖譜的每條帶均為一個分子標記，代表一個引物的結合位點。根據條帶的有無統計所有的二元數據;有帶記作1，無帶記為0;根據二元數據計算多態性位點百分數，采用NTSYS統計分析軟件[7]對數據進行分析，品種間的相似系數按Jaccard公式計算，以非加權類平均法(UPGMA)進行聚類分析，并建立樹狀圖。

2結果與分析

2.1引物篩選與SSR多態性

從15對SSR引物中篩選出12對多態性較高#65380;穩定性較好#65380;分辨率較高的引物。12對引物在18個供試品種中共擴增出80條DNA譜帶(表2)，其中多態性帶有56條，占擴增總帶數的70%，所擴增的片段大小在100~300bp之間，不同引物擴增的帶數在1~11之間，平均5~6條。用W0622106#65380;W0622114#65380;W0622094#65380;W0622116這4對引物可以鑒別18個供試品種中的17個品種，由此可以說明，用SSR來鑒別扁桃品種效率很高，這些引物可以用于扁桃及其他桃屬品種的鑒別，以便及時參考使用。分析引物W0622116的PCR擴增產物(圖1)可以看出，一些看似親緣關系較遠的部分品種的帶型較相似，例如莎車17號#65380;莎車23號#65380;英吉莎2號及晚熟毛桃;而有些品種的帶型差異卻較大，例如莎車3號#65380;莎車15號#65380;莎車2號#65380;莎車22號#65380;莎車1號，說明在基因型高度雜合的扁桃品種群體內，存在著極為復雜的譜帶關系。

2.2扁桃品種的聚類分析

根據12對引物的擴增數據計算品種間的相似系數，并構建聚類樹狀圖(圖2)。18個供試品種(含近緣種)的相似系數在0.538~1.000之間，平均為0.769，16個扁桃品種，1個晚熟毛桃和1個榆葉梅均能分開。根據聚類結果，在遺傳距離為0.70的熵值下可將供試18個品種劃分為5個類群。第1類群與其他品種間遺傳距離較大，但只包含莎車1號1個品種;第2類群包含榆葉梅1個品種;第3類群包含莎車15號1個品種;第4類群包含莎車2號#65380;英吉莎2號#65380;晚熟毛桃3個品種;第5類群包含其余所剩品種。本結果說明了各個扁桃品種#65380;桃#65380;榆葉梅基因型遺傳背景的共同性和變異多樣性。

3討論

聚類結果與傳統系譜也存在差別，例如莎車15號和莎車12號等扁桃品種的遺傳距離相對較遠，原因一是生產上常用的扁桃品種是依據其商業性狀進行人工選擇而出來的，所檢測的位點可能與其重要的商業性狀不是連鎖的;二是不同的選擇標準導致了復雜的遺傳多樣性;三是所檢測的位點較少，不能完全反映出整個扁桃基因組的復雜情況，導致系譜偏離。

SSR分析中最重要的環節是引物的篩選，只要能開發出合適的引物，并對分析體系進行優化，就能挖掘SSR在種質資源研究中的巨大潛力。本試驗通過對16個扁桃品種#65380;1個榆葉梅和1個晚熟毛桃的SSR進行分析后可知，DNA多態性豐富，其中某些特征條帶可以作為品種轉育過程中的血緣而加以控制，以便合理地利用。本試驗結果將為新疆扁桃雜交育種過程中的血緣控制和親本選配#65380;以及研究物種起源和演化提供技術和理論支持。

參考文獻:

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