姜黃素對淀粉樣前體蛋白/早衰素1雙轉基因小鼠學習記憶能力及Wnt信號通路相關蛋白表達的影響

宋曉環 姚曉媛 王忠超 胡金秋 朱莉

(長春醫學高等專科學校病理教研室，吉林 長春 130031)

阿爾茨海默病(AD)是從階段性記憶障礙到全面性認知障礙的一種神經變性疾病，同時也是一種與年齡相關的神經系統原發性退行性病變，多在中老年人發病，因此又稱為老年性癡呆〔1～3〕。目前對AD的延緩和控制尚無理想方案。研究表明〔4,5〕，姜黃素對β樣淀粉蛋白(Aβ)的神經毒性作用已得到證實，因此姜黃素對AD的潛在治療作用日益受到關注，其作用機制研究成為研究熱點。本實驗擬分析姜黃素如何調節Wnt信號通路相關蛋白β-連環蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β和海馬區記憶蛋白海馬區突觸前蛋白(Synapsin)1、海馬區突觸后蛋白(PSD)-95的陽性表達強度及mRNA水平，從而達到提高AD小鼠的學習記憶能力以發揮防治AD的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物和分組 實驗動物來源于遼寧長生生物技術股份有限公司，選取雙轉基因雄性淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素(PS)1小鼠30只，體質量(24.2±1.4)g，隨機分為模型組、鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組，每組10只；用同月齡、同體系野生雄性C57BL/6小鼠10只作為空白對照組，體質量(23.8±1.3)g；4組均給予正常飲食。

1.2實驗主要儀器設備 Morris水迷宮(Panlab公司，西班牙)；Leica2245切片機(Leica公司，德國)；OLYMPUS BX51光學顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)；ABI7300實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(Biotek公司，美國)；Biometra PCR擴增儀(Biotek公司，美國)。

1.3實驗主要試劑 姜黃素由上海遠慕生物科技公司提供；鹽酸多奈哌齊由安理申衛材藥業有限公司提供(國藥準字H20070181)；鼠抗β-catenin和GSK-3β抗體購于Abcam公司；鼠抗海馬區Synapsin1、海馬區PSD-95抗體購于武漢三鷹公司；SP9710和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物技術有限公司； Trizol購于Invitrogen公司；Taq酶、DL2000 marker和實時熒光定量(RT)-PCR反轉錄試劑盒購于塔克拉公司；引物由上海生物工程有限公司提供。

1.4給藥方法 4組給藥方式均為灌胃，空白對照組和模型組每天一次給予生理鹽水(0.1 ml/10 g)、鹽酸多奈哌齊組每天一次給予鹽酸多奈哌齊(3.25 mg/kg)、姜黃素組每天一次給予姜黃素(50 mg/kg)，給藥時間為8 w。

1.5各組學習記憶能力 進行Morris水迷宮試驗〔6〕，在實驗結束前5 d，水迷宮連續訓練4 d，第5天測試小鼠逃避潛伏期、經過平臺次數和平臺象限停留時間。

1.6各組甲醛溶液腦組織海馬區神經細胞的損傷程度 治療8 w結束后，處死小鼠并取腦組織海馬區，放入甲醛溶液固定后常規脫水、透明、浸蠟和包埋，制備5 μm切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色，通過OLYMPUS BX51光學顯微鏡下觀察腦組織海馬區神經細胞損傷程度。

1.7免疫組織化學染色檢測各組腦組織海馬區β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白陽性表達 制備3 μm石蠟切片4張，分別進行4種抗體的免疫組織化學染色(SP法)，觀察β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白陽性表達強度，陽性表達呈棕黃色、細胞核用蘇木精復染為藍色。通過Motic Images Advanced3.2圖像分析軟件半定量分析蛋白陽性表達強度，分析結果以光密度值(OD值)表示，OD值越大陽性表達越強。

1.8RT-PCR檢測各組腦組織海馬區β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的mRNA水平 用Trizol提取腦組織海馬區總RNA，所有樣本基因擴增3次，行RT-PCR檢測β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平。

1.9統計學分析 采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組Morris水迷宮逃避潛伏期、經過平臺次數和平臺象限停留時間 與空白對照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長、經過平臺次數明顯減少、平臺象限停留時間明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組逃避潛伏期明顯縮短、經過平臺次數明顯增加、平臺象限停留時間明顯延長(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組各指標差異無統計學意義(P>0.05)；見表1。

表1 各組Morris水迷宮逃避潛伏期、經過平臺次數和平臺象限停留時間的比較

與空白對照組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2各組腦組織海馬區神經細胞損傷程度 形態學觀察，空白對照組海馬區神經細胞排列整齊、緊密、多層規則、細胞核大核仁清晰；模型組海馬區神經細胞排列松散、層數減少、不規則、細胞核固縮、體積減小、細胞周隙明顯；鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組海馬區神經細胞較模型組明顯數量增多、體積增大、細胞周隙縮小、細胞固縮壞死減少。見圖1。

2.3各組腦組織海馬區β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白陽性表達和mRNA水平 與空白對照組比較，模型組Wnt信號通路相關蛋白(β-catenin、GSK-3β)和海馬區與記憶相關的蛋白(Synapsin1、PSD-95)的陽性表達強度和mRNA水平明顯降低(P<0.05)， 鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組β-catenin、GSK-3β和海馬區Synapsin1、PSD-95蛋白的陽性表達強度和mRNA水平亦顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組β-catenin、GSK-3β和海馬區Synapsin1、PSD-95蛋白的陽性表達強度和mRNA水平明顯升高(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組各指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

組別β-catenin蛋白GSK-3β蛋白Synapsin1蛋白PSD-95蛋白 β-catenin mRNAGSK-3β mRNASynapsin1 mRNAPSD-95 mRNA空白對照組 6.42±0.57 6.91±0.766.12±0.536.04±0.31 1.69±0.15 1.85±0.261.49±0.121.16±0.05模型組 1.19±0.151)1.24±0.381)1.17±0.421)0.98±0.161) 0.37±0.061)0.52±0.051)0.31±0.051)0.22±0.031)鹽酸多奈哌齊組4.05±0.211)2)4.36±0.411)2) 3.97±0.351)2)3.82±0.341)2)1.12±0.111)2)1.24±0.181)2) 1.07±0.091)2)0.81±0.071)2)姜黃素組4.18±0.391)2)4.29±0.521)2) 4.01±0.481)2)3.91±0.271)2)1.18±0.091)2)1.29±0.131)2) 1.15±0.081)2)0.86±0.041)2)

3 討 論

AD是老年癡呆的常見類型，目前其發病機制尚不清楚，其發病率和死亡率隨著社會人口老齡化、生活壓力的增加而逐年升高〔7～9〕。

姜黃素是從草本植物姜黃根莖中提取出的一種多酚類化合物，以往研究表明姜黃素具有較好的生理活性，能夠清除自由基、降血脂、抗炎、抗腫瘤及抑制Aβ的神經毒性作用，其在癡呆領域里應用有著潛在的防治意義〔10，11〕。AD與Wnt信號分子有著密切的聯系，Wnt信號通路相關蛋白可以通過自分泌或旁分泌的方式作用于神經細胞膜，從而激活細胞內信號傳導通路，調節靶基因活動〔12〕。Wnt信號通路是生物進化過程中高度保守的信號通路，也是人體發育過程重要的信號通路之一，如果Wnt信號通路中的相關蛋白發生突變，將會導致各種疾病的發生，其對神經系統的發生發展尤為重要〔13～15〕。Wnt信號通路相關蛋白β-catenin和GSK-3β能調控海馬區記憶蛋白海馬區Synapsin1和PSD-95，AD小鼠β-catenin、GSK-3β的下調能誘導記憶蛋白Synapsin1、PSD-95的下調〔16～18〕。

綜上，姜黃素與鹽酸多奈哌齊有同樣的治療效果，能顯著提高AD小鼠空間學習記憶能力；其可通過上調β-catenin、GSK-3β和記憶蛋白Synapsin1、PSD-95的蛋白陽性表達強度及mRNA水平，提高AD小鼠的學習記憶能力以發揮防治AD的作用。