ＰＣＲ技術在動物檢疫中的新應用

中圖分類號：S188 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X(2008)07-0014-02

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術自1985年建立以來，經過了20余年的發展，應用日益廣泛，體現了其強大的生命力。對病原體核酸的擴增被廣泛應用于動物病原體的檢測中。并在動物檢疫中發揮著越來越大的作用。

PCR作為現代分子生物學的核心技術，在科學研究和臨床診斷中都發揮了巨大的作用。這項技術經過不斷的開發和改進，已經應用到動物檢疫領域的各個環節。給我們的工作帶來極大的便利。在PCR技術基礎上衍生出很多新技術，在動物檢疫中逐漸被采用的PCR技術主要有多重PCR和熒光PCR技術。

1 多重PCR技術

多重PCR最先被用于疾病的診斷是1988年Chamber-lain將其應用于人的杜氏肌營養不良(DMD)基因外顯子的檢測。隨后，在人醫上被廣泛應用于各種疾病的診斷。1993年，WirzB將其用于豬瘟病毒和其他瘟病毒屬的鑒別診斷，從而拉開了在獸醫診斷領域應用多重PCR的序幕。隨后該技術不斷的被報道用于動物細菌性、病毒性、寄生蟲性疾病等的診斷，被公認為是一種方便、快速、敏感、特異的診斷方法。

1.1 方法的特點

多重PCR是在常規PCR的基礎上發展而來的。因此，其基本原理和常規PCR沒有差別，所不同的是多重PCR技術是在同一個體系中加入多對引物，同時檢測多個目標序列的存在。理論上講，引物條數可以不加限制，但是實際操作中，由于隨著引物條數的增加，引物之間的相互作用變得更為復雜，二聚體和錯配的幾率大大增加，優化各種條件變得更為困難，從而影響引物的擴增效果。雖然目前已有同時用9對引物擴增出相應目標片段的報道，但是實際工作中通常以使用引物不超過5對為好。在把單重PCR合并成多重PCR之前要進行不同擴增子之間引物的分析，條件進一步優化。

1.2 方法的應用

多重PCR在動物中使用相當普遍，主要用于病原體強弱毒株的區分、鑒別診斷和分型鑒定等。

1.2.1 毒力強弱分析 新城疫是家禽的一種烈性傳染病。但有時卻表現出慢性疾病的特點，無典型的臨床癥狀。因而需要一種不僅能夠診斷該病而且能快速區別病原是強毒株還是弱毒株的方法。早期的研究多集中在RT-PCR擴增結合序列分析的方法上，雖然也不失為鑒別診斷新城疫的準確可靠的方法，但測序比較煩瑣，成本也較高，難以進行大批量操作。20世紀80年代末到90年代初。新城疫基因組結構的闡明為建立這種鑒別診斷方法提供了可能。通過對大量不同毒力新城疫基因核苷酸序列的分析，根據強弱毒株FO裂解位點的序列差異設計合成了3對引物，建立了快速診斷新城疫并能鑒別其強弱毒株的反轉錄一聚合酶鏈式反應，該方法具有快速特異和操作簡便的特點，不僅適用于對雞胚毒的檢測，而且適用于對病雞組織勻漿液的檢測，是新城疫鑒別診斷和流行病學調查的頗具潛力的分子診斷方法。

1.2.2 鑒別診斷 雞傳染性支氣管炎(IB)、禽流感(AI)、雞傳染性喉氣管炎(ILT)、雞新城疫(ND)是嚴重危害雞群的4種主要呼吸道傳染病。這些傳染病感染不同年齡雞群，具有較高的發病率和死亡率，曾給養雞業造成沉痛的打擊和巨大的經濟損失。由于這些病原引起雞表現相似的臨床癥狀和病理剖解變化，用傳統的臨床診斷方法難以區別，并且這些方法常受臨床病料新鮮度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁瑣費時。根據4種傳染病的各自保守序列設計4重PCR，由擴增后得到的特異性片段的大小來診斷是哪種疾病引起。

豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)、典型豬瘟病毒(CS，FV)、圓環病毒(PCV)、細小病毒(PPV)、流行性乙型腦炎病毒(JEV)和豬偽狂犬病毒(PRV)是引起豬繁殖障礙的常見病原，在臨床上常呈混合感染。多重PCR技術用于PRRSV、CSFV、PCV、PPV和JEV感染的診斷能同時檢測5種病毒的感染。

1.2.3 動物病原體的分型鑒定 豬鏈球菌分為35個莢膜血清型，1、2、1/2、7、9和14型從發病豬和死豬體內最常分離到的血清型。其中以2型致病性和毒力最強，其他血清型有的毒力偏弱、危害較少。有的甚至在臨床上并不導致疾病。因此，在實踐中。需要將2型豬鏈球菌與其他型分開。2型和1/2型豬鏈球菌的毒力基因cps基因中有幾段是其他血清型豬鏈球菌沒有的(cps2F、cps2H、cps2I和cps2J)。建立同時檢測這些獨有基因和共有基因的多重PCR就可以將2型、1/2型豬鏈球菌與其他型分開。

流感病毒的基因組極易發生變異，其中以編碼血凝素(HA)的基因的突變率最高，其次為神經氨酸酶(NA)基因。迄今已知有16種HA和10種NA，不同的HA和NA之間可能發生不同形式的隨機組合，從而構成許許多多不同亞型。據報道，現已發現的流感病毒亞型至少有80多種，其中絕大多數屬非致病性或低致病性，高致病性亞型主要是含H5和H7的毒株，特別是H5亞型禽流感病毒可以導致人的死亡，具有重要的公共安全意義。鑒別診斷H5與其他亞型的多重PCR技術已經在動物檢疫中廣泛使用。

2 熒光PCR技術

實時熒光PCR技術于1996年由美國Applied Biosys-terns公司推出，可以分為探針法和SYBR Green I熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術在原理上更為嚴格，所得數據更為準確。熒光PCR把PCR的靈敏度和特異性大大提高，靈敏度接近檢測方法的極限，熒光探針增加了檢測的特異性。

2.1 熒光PCR技術特點

第一是實現了實時檢測。能在反應結束后得到PCR擴增動力學曲線。從而很直觀地反映整個PCR過程的動態變化。檢測點以Ct值為標準，當熒光信號達到Ct值時，PCR反應體系內各種成分均處于最佳飽和狀態。受各種干擾因素的影響最少，最能反應體系中模板的起始含量。第二是具有良好的穩定性和重復性，Gerard報道用熒光定量PCR方法，重復40次反應。其Ct值的變異系數為1，6％。如使用電泳后凝膠掃描定量。其變異系數高達31％，兩者相差19倍多。第三是用熒光信號的指示劑顯示擴增產物的量，能獲得較高的檢測精度，因為熒光檢測的靈敏度顯著高于肉眼觀察電泳條帶的靈敏度。第四是在熒光定量PCR過程中，除加樣一次開蓋外，其余過程在閉管情況下進行，反應結束后在電腦上顯示，不需要后期的凝膠電泳，有效杜絕了產物污染造成的假陽性問題，同時避免了溴化乙錠或同位素對人體及環境的危害。第五是操作簡單、快速，工作效率高。整個過程由電腦控制，從加樣到結果出來只需要2h左右，內置9600型PCR擴增儀，可同步完成96個樣品的擴增及定量，適宜于大批樣品的檢測處理，有利于操作規程的標準化。

熒光PCR也可以設計多重，即多重熒光PCR，通過不同的探針標記不同的發光集團實行熒光分類從而實行多重檢測的目的。目前，市面上流行的熒光PCR儀中，ABI公司的7500最多可以檢測5個通道的熒光，也就是說最多可以進行5重熒光PCR檢測。

2.2 熒光PCR的應用

熒光PCR由于具備更多的優勢，因此在動物檢疫中受到更多的青睞。除了需要對PCR產物進行下游處理的試驗外，幾乎所有PCR進行的工作都可以由熒光PCR來完成。進出口檢驗中對方法的靈敏度要求很高，要求有微量的病原體就能夠檢出，熒光PCR正好可以發揮它的優勢。

2.2.1 動物病毒檢測 熒光定量PCR技術在動物病毒性疾病的診斷及定量檢測中已經被廣大臨床診斷實驗室所接受，現在國內外已經有很多實驗室都建立了快速檢測病毒的方法，病毒分離結果一致。英國科學家Schweiger報道應用熒光PCR對咽喉拭子等呼吸道標本中禽流感病毒進行型別、亞型鑒定，結果表明敏感性高于常規的病毒分離、培養方法。深圳四基生物工程公司與北京出入境檢驗檢疫局研制出了AIV熒光RT-PCR檢測試劑盒。基于該技術的檢測試劑在全國各個出入境檢測實驗室得到了廣泛使用，為有效控制禽流感疫情在國際間的傳播起到顯著的作用。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMDV感染引起的偶蹄動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病。患病動物的口、舌、唇、蹄和乳房等部位出現水泡，破潰并形成爛斑。該病一經檢出，相應的家畜及畜產品就禁止運輸和出口，造成巨大的經濟和政治影響。FMD的暴發和流行除了對畜牧業生產造成巨大的損失外，對人民生活所需要的奶品、肉品供應也造成很大的影響，故各國對FMD的檢驗檢疫非常嚴格。FMD檢測可以通過病毒分離、補體結合實驗(CFF)、病毒中和實驗(VNT)和動物接種實驗等方法。然而，這些方法費時費力。特異性和靈敏度也無法滿足需要。急需一種快速、準確的檢測技術。在我們國家，檢驗檢疫系統中首先建立了口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測技術，之后形成檢驗檢疫行業標準，成為進出口動物及動物產品的重要檢疫規范。

此外，熒光PCR新城疫病毒和豬藍耳病病毒的檢測方法已經建立。部分口岸實驗室也在應用。

2.2.2 動物細菌病檢測 2005年6月，四川省資陽、內江相繼暴發豬鏈球菌病，截止到8月20日，累計報告人感染豬鏈球菌病病例204例。死亡38例。這些事件不但造成了人員傷亡，而且引發了全國性的食品安全恐慌，造成巨大的經濟損失。全國多個動物檢疫實驗室建立了熒光PCR檢測2型豬鏈球菌的檢測技術，其中珠海出入境檢驗檢疫局建立的多重熒光PCR檢測技術同時檢測2型豬鏈球菌的莢膜多糖基因cps2I和溶菌素釋放蛋白基因MRP，對于控制疫情、減少擴散起到積極作用。

炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的一種人獸共患病，炭疽芽孢桿菌可通過消化道、呼吸道及皮膚接觸感染人和動物，具有高度致病性，特定條件下炭疽芽孢桿菌可以形成芽孢，抵抗力強，在外界環境中可存活數十年。2002年美國出現的炭疽生物恐怖事件更是給人們敲響了警鐘，快速準確的檢測技術對于炭疽的監測和控制具有重大意義。張玲建立了SYBR GREEN I染料法熒光PCR技術，實現了炭疽桿菌的快速檢測。2005年陳蘇紅等針對炭疽桿菌的pX01和pX02質粒建立了Taqman探針熒光PCR檢測技術，使檢測的特異性和靈敏度大大提高。根據實驗數據，他們的研究都取得了不錯的效果，有望在實踐中，特別是進出口檢驗中發揮越來越大的作用。

另外，大腸桿菌0157、霍亂沙門氏菌也都建立了相應的熒光PCR檢測技術，對保障進出口動物健康和食品安全具有重要作用。

3 小結

新技術的出現往往給生產和應用帶來巨大的便利，PCR技術作為現代分子生物學的核心技術，已經在實踐中發揮出無法替代的作用。然而，所有的檢測方法都有自身的不足，基于核酸擴增的PCR技術也不例外。RNA病毒的快速變異使我們無法知道下一個突變發生在什么地方，如果新的毒株在我們的檢測區域發生突變，就可能出現漏檢現象。特別是熒光PCR技術，如果在探針位置出現不匹配，檢測很可能出現假陰性。我們曾經在實驗中使用過10多套引物、探針檢測口蹄疫病毒，并且在一些位點使用了兼并堿基，然而。沒有一套可以從理論上兼顧到所有的毒株。也就是說，沒有一套引物可以成功擴增迄今為止出現的所有口蹄疫病毒，只能在盡可能保守的區域設計引物、探針，進而隨著病毒變異不斷嘗試新的檢測區域。特別是型特異性引物、探針的設計，必須是在型內高度保守、型間易于區分的區域，給研究人員帶來了一定的挑戰。實際上，一些研究者在進行單個病原體的檢測時已經開始使用多重PCR或者多重熒光PCR，只要有一個特異性片段出現就可以判斷結果陽性。生產實踐中的需要使PCR技術已經得到了很大的改進和發展，相信隨著新問題的出現，新的技術方法和原有方法的新應用會不斷出現。