構建組織工程化耳廓軟骨修復體

張 路 綜述 周廣東 曹誼林 審校

因先天性小耳畸形、外傷、腫瘤造成的外耳缺損或缺失在臨床中較為常見。目前治療的手段主要是采用切取的自體肋軟骨，并對其雕刻成型重建患耳[1-2]。但其不同程度的存在耳廓造型不一，供區繼發缺損等問題。組織工程技術[3]的出現無疑為無（微）創修殘補缺提供了可能。目前的軟骨組織工程技術主要是利用自體軟骨細胞或成體干細胞作為種子細胞，接種在具有三維多孔結構的可降解支架上，通過特定的培養構建方法，最終形成軟骨組織以修復缺損。

1目前已有的報道：

目前PUBMED上可以檢索到構建組織工程化耳廓軟骨修復體的相關文獻共9篇[4-12]（從1997年～2007年），按照發表時間，期刊名稱、作者、實驗所用組織工程支架材料、種子細胞、耳廓形態和構建方法等順序總結如表1。

2存在的問題

2.1 種子細胞：以上文獻所用的種子細胞均為自體或異體軟骨細胞。軟骨細胞是組織工程軟骨研究最早，也最常采用的種子細胞來源。但從機體自身軟骨組織獲取細胞，一方面會造成供區繼發軟骨缺損，另一方面從供體組織獲取的軟骨細胞的增殖能力有限，容易在體外培養擴增的過程中出現去分化現象[13-14]，失去軟骨細胞表型，所以不能滿足大體積組織工程化軟骨形成的細胞數量要求。目前認為較有臨床應用前景和可行性的組織工程軟骨種子細胞是間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），這些MSCs取材創傷小，增殖力強，能被定向誘導為軟骨表型細胞[15-18]，有望解決軟骨組織工程種子細胞來源不足的難題。

2.2 支架材料：以上文獻所采用的支架材料分為兩類，一類是當前組織工程支架材料方面最常選用的聚羥基乙酸及其類似纖維合成聚合物，因其具有良好的生物相容性和生物可降解性，并已充分證實了其與軟骨細胞復合構建成熟軟骨組織的穩定效果[19-20]。但是，要將棉絮樣的無紡聚羥基乙酸纖維加工預塑形成精確的耳廓形態一直是一大難題。另一類是凝膠狀支架材料，如Pluronic F-127，纖維蛋白膠等，復合細胞后是修補小面積不規則缺損的理想支架材料，但作為具有特定形態的大器官構建（如耳廓，氣管，外鼻軟骨等）用還存在塑形困難及力學強度不足等問題。同時，使用該類支架不利于體外構建。

2.3 組織構建：目前已有的報道多集中于應用軟骨細胞與手工制作的耳廓形態支架材料復合后植入免疫缺陷動物（如裸鼠）體內構建耳廓軟骨，但其存在取膜工藝復雜、所得耳廓軟骨產物由健側耳所得、外型不佳等問題，造成該修復體缺乏臨床應用價值（尤其針對先天或后天性外耳畸形或缺損病例）。此外，細胞-支架材料復合物能否在免疫功能健全的動物體內形成成熟的軟骨，而不至于被排斥、吸收及受壓變形有待進一步證實。所以，建立穩定的具有免疫功能的大動物模型是未來組織工程軟骨真正實現臨床應用的必經之路。

3臨床應用尚需解決的問題

3.1 可塑性：組織工程化耳廓修復體要實現臨床應用，首先要解決的是可塑性的問題。目前，要把生物支架材料加工成個體差異非常大的、與健側耳相對稱的耳廓修復體還是一大難題。計算機輔助設計(Computer Aided Design， CAD)和快速成型(Rapid Prototype， RP)技術[21-22]的出現無疑為這一問題的解決提供了一種可能。它能將病人的正常耳廓數據導入計算機并進行個性化設計，再通過生物打印技術將組織工程用支架材料直接打印出來，從而可以直接對細胞進行接種。此外，該支架復合細胞后所構建的產物要有足夠的強度去對抗植入人體皮下所帶來的張力從而維持原先的形狀，這對支架材料的強度提出了新的要求。

3.2 修復體外露及吸收：修復體外露及吸收容易發生在早期細胞支架復合物植入過程中，由于支架尚未完全降解甚至細胞及其細胞外基質尚未充分包埋支架，容易造成機體對支架及其降解產物的無菌性炎癥反應，炎癥細胞侵潤，釋放炎性因子，交界面無法愈合，從而造成修復體外露及吸收。因此，細胞支架復合物的體外預構建十分重要，不僅可以使支架降解、細胞及其細胞外基質充分包埋，同時也可以對植入物進行必要的生物相容性檢測及生物力學檢測。

3.3 無法控制的細胞增殖：在應用干細胞作為種子細胞進行誘導構建軟骨的過程中，干細胞的安全性問題一直是爭論的焦點。尤其是胚胎干細胞，其高度的成瘤性[23-24]將直接限制其臨床應用。而成體干細胞被認為無成瘤性，但目前尚缺乏體內長期追蹤及人體臨床試驗的安全性證據。

3.4 耳廓軟骨的性質：耳廓軟骨是人體最大的彈性軟骨，組織學和生物力學性質都與其它類型的軟骨（包括透明軟骨及纖維軟骨）有所不同，因其細胞外基質內含有彈性纖維。而目前所構建的組織工程化軟骨尚無法形成含有類似正常彈力纖維的軟骨，也缺乏相關研究的報道。

3.5 供區損傷：盡管組織工程的種子細胞可以在體外不斷擴增培養，但以軟骨細胞為例，因其增殖能力有限，容易在體外擴增的過程中出現去分化現象。所以取材時需要對較大的軟骨塊進行細胞收集。排除肋軟骨取材的并發癥，肋軟骨本身細胞/基質比很低，會造成不宜消化及所得相對細胞數較少等問題，因此不利于臨床應用。而按照目前構建正常耳廓所需的軟骨種子細胞數量（大約4～5×108），單純切取小塊鼻中隔軟骨及耳甲腔軟骨用以收集細胞是不能滿足要求的。而應用成體干細胞作為種子細胞構建軟骨，其供區損傷要相對小得多。

3.6 細胞擴增：軟骨增殖能力有限，容易在體外擴增的過程出現去分化現象，所以目前一般用到第3代細胞已經是極限。而成體干細胞增值能力非常強，可以以極低密度傳代，理論上可以獲得足夠量的細胞。但就目前的細胞培養條件而言，一個10cm直徑的培養皿平均只能容納106～107個細胞，這樣就需要耗費大量的人力、財力和時間，因此很難實現臨床推廣。而目前出現的微載體細胞培養方法[25-28]大大提高了細胞擴增培養的效率，有望解決細胞擴增的問題。

3.7 可能出現的倫理學問題：雖然醫生們對干細胞技術及其應用持歡迎態度，但目前還是有很多國家法律立法限制其研究，尤其是針對胚胎干細胞。因為它很大程度上與生命的起源相關聯。

4總結

近10年來，組織工程技術在醫學各個領域都取得了長足的進步，其中組織工程化耳廓軟骨是幾個比較具有實踐性和應用性的組織工程產品之一，它是組織工程基礎研究向臨床應用轉化的必然過程，雖然還有不少問題有待解決。但筆者相信，隨著我國863、973等重點科技計劃項目對組織工程進行立項，以及國內外組織工程研究熱潮的興起，新技術、新材料、新發明的不斷涌現，不久的將來可以看到類似于組織工程化耳廓軟骨等相關產品應用于整形外科乃至整個醫學科學領域。

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[收稿日期]2008-07-25[修回日期]2008-09-27

編輯/張惠娟