ＴＧＦ－β_１基因－５０９Ｃ／Ｔ單核苷酸多態(tài)性與病理性瘢痕易感性研究

[摘要]目的：探討轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)基因-509C/T多態(tài)性與中國漢族人群病理性瘢痕的相關(guān)關(guān)系。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)-反向點雜交、DNA直接測序方法檢測了155例病理性瘢痕患者與120名正常對照的TGF-β1基因-509C/T多態(tài)性位點的基因型。結(jié)果：病理性瘢痕患者的C等位基因頻率明顯高于正常對照組(χ2=4.676，P=0.031)。病理性瘢痕患者的C/T、T/T基因型頻率與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為0.763和1.376;P值分別為0.382和0.241)，而病理性瘢痕患者的C/C基因型頻率明顯高于對照組(χ2=5.493，P=0.019)。提示C/C基因型者患病理性瘢痕的風(fēng)險性明顯高于C/T、T/T基因型者(OR=2.041，95%CI:1.116～3.73)。結(jié)論：TGF-β1基因-509位點C等位基因及C/C基因型可能是病理性瘢痕的易感因素。

[關(guān)鍵詞]病理性瘢痕；TGF-β1基因；多態(tài)性；遺傳易感性

[中圖分類號]Q813[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）08-1170-03

TGFβ1-509C/T polymorphism and susceptibility to abnormal scar in Han Nationality of Chinese population

ZHUO Yang，ZENG Xing-ye，ZHOU Xue-xue，HUANG Da-dao，PAN Ruo-wang，CAO Xiao-en

（Department of Surgery，the 118th Hospital of PLA，Wenzhou 325000，Hangzhou，China）

Abstract： ObjectiveTo investigate the relationship between TGFβ1-509C/T polymorphism and susceptibility to abnormal scar in a southern Chinese population.MethodsThe TGFβ1-509 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 155 patients with abnormal scar and 120 unrelated healthy controls. ResultsThe frequency of the TGFβ1-509 C allele among abnormal scar patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4.676，P=0.031). The C/T and T/T genotype distribution among abnormal scar patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=0.763and 1.376; P=0.382 and 0.241， respectively). However， the C/C genotype frequency among abnormal scar patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.493，P=0.019). The TGFβ1-509 C/C genotype significantly increased the risk for developing abnormal scar，compared to the combination of C/T and T/T genotypes，with the odds ratio(OR) of 2.041， (95%CI: 1.116～3.731).ConclusionTheTGFβ1-509 polymorphism may play a role in susceptibility to abnormal scar.

Key words: abnormal scar; TGFβ1 gene ; polymorphism; genetic susceptibility

瘢痕形成是高等哺乳動物創(chuàng)傷愈合的自然結(jié)局，但瘢痕異常增生則會產(chǎn)生病理性瘢痕，特別是發(fā)生于頭頸部者可造成面容畸形、器官移位和功能障礙，尤其是對于患者心理方面造成的影響常會嚴(yán)重干擾其正常工作和生活。因而，研究瘢痕形成與增生的機理及其防治措施，是目前醫(yī)學(xué)整形美容領(lǐng)域內(nèi)函待解決的問題之一。

TGF-β1基因是目前較為關(guān)注的與病理性瘢痕相關(guān)的基因之一，分子生物學(xué)研究表明TGF-β1存在著基因變異及基因多態(tài)性，而關(guān)于TGF-β1基因多態(tài)現(xiàn)象與病理性瘢痕的關(guān)系鮮見報道，為此，我們從分子遺傳學(xué)角度探討TGF-β1基因-509C/T多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群病理性瘢痕發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系， 以便深入地， 多層次的解析病理性瘢痕的分子生物學(xué)機制。

1對象和方法

1.1 研究對象：病理性瘢痕患者和正常對照人群均為浙江地區(qū)居民。病理性瘢痕患者均經(jīng)本院臨床及病理診斷證實，共155例，其中男96例、女59例，年齡10～56歲，平均年齡27.6歲，病變位于頸肩、胸部、腋下及上下肢關(guān)節(jié)等部位，病史5個月～12年。正常對照為有外傷史而無增生性瘢痕或病理性瘢痕產(chǎn)生的健康居民，共120例，其中男63例、女57例，年齡13～58歲，平均年齡28.4歲。用于基因分析的DNA全部來源于研究對象的外周靜脈血，血樣本用枸櫞酸鈉抗凝，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)-反向點雜交（PCR-RDB）

1.2.1基因組DNA提?。翰捎帽本┵惏賱偕锛夹g(shù)有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 ASO（等位基因特異性寡核苷酸）探針設(shè)計：應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計探針，氨基標(biāo)記，探針序列分別為：NH2-5′- CTTCCATCCCTCAGGTGTCC-3′；NH2-5′- CTTCCATCCTTCAGGTGTCC -3′，由上海生工生物公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)：用于擴增TGF-β1基因-509位點的引物5′端標(biāo)記了非同位素檢測介質(zhì)Biotin，引物序列為：Bio-5′- CAGACTCTAGAGACTGTCAG -3′；Bio-5′- GTCACCAGAGAAAGAGGAC -3′，由上海生工生物公司合成。反應(yīng)在PE-480型擴增儀(美國PE公司)上進行。在50μl反應(yīng)總體積中，含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎國生物公司)。熱循環(huán)參數(shù)：94℃熱啟動5min后，94℃40sec，55℃1min，72℃/2min；共35個循環(huán) 72℃延伸 5min。取3μl擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，紫外透射儀下觀察結(jié)果。

1.2.4 雜交：固化上寡核苷酸探針的膜條連同40μlPCR產(chǎn)物加入含5ml2×SSC～0.1%SDS的試管中，100℃水浴變性7min，置雜交儀中42℃雜交3～6h；然后放入42℃預(yù)熱的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；將膜條轉(zhuǎn)入含2.5U辣根過氧化物酶連鏈酶抗生素蛋白的10ml2×SSC～0.1%SDS試管中，室溫反應(yīng)15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，將膜條轉(zhuǎn)入20ml顯色液[19ml0.1mol/L檸檬酸鈉(pH5.0)中加30%過氧化氫3μl和0.1mg/mlTMB]中避光顯色5～15min，期間觀察、記錄結(jié)果。

1.3 為檢驗反向點雜交結(jié)果的正確性，隨機抽取15例PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物公司測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗分析各組等位基因和基因型頻率分布的差異，并計算表示相對風(fēng)險度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidenceinterval，CI)。

2結(jié)果

根據(jù)我們設(shè)計的方案，雜交結(jié)束后膜條上格顯示藍紫色斑點為C/C基因型，中格顯示藍紫色斑點為T/T基因型，而上、中全部顯示為C/T基因型，下格為空白對照，無斑點顯示（圖1）。病理性瘢痕組和正常對照組TGF-β1基因多態(tài)性比較如表1所示。

病理性瘢痕組的C等位基因頻率(49.7%)明顯高于正常對照組(40.4%，χ2=4.676，P=0.031， P＜0.05)。病理性瘢痕組的C/T、T/T基因型頻率分別為43.9%和28.4%，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為0.763和1.376；P值分別為0.382和0.241)。而病理性瘢痕組的C/C 基因型頻率為27.7%，明顯高于正常對照組(χ2=5.493，P=0.019，P＜0.05)。與C/T、T/T基因型相比， C/C基因型者患病理性瘢痕的相對風(fēng)險性(OR)明顯增高(OR=2.041，95%CI:1.116～3.731)。

我們隨機抽取的15例PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與反向點雜交結(jié)果完全吻合，證明了聚合酶鏈反應(yīng)-反向點雜交結(jié)果的正確性。

3討論

外傷、感染、燒傷、外科手術(shù)等均可造成病理性瘢痕。一直以來，病理性瘢痕被認(rèn)為是由于各種原因引起成纖維細(xì)胞的異常增殖和膠原纖維大量合成，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）中膠原過度沉積所致[1]。其中，成纖維細(xì)胞又被認(rèn)為是病理性瘢痕形成的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其功能狀態(tài)是影響病理性瘢痕發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸的主要因素。而目前其產(chǎn)生的深入內(nèi)因、形成的機制尚未完全清楚[2]，并且在臨床工作中也缺乏有效、可靠的治療方法。

近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展進入到細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)水平，在該領(lǐng)域開展的基礎(chǔ)研究也取得一定進展，并已將成果應(yīng)用于臨床治療。特別是細(xì)胞因子在病理性瘢痕的形成中所起重要調(diào)節(jié)作用已越來越受到廣泛關(guān)注。細(xì)胞因子是一種存在于人體中極微量的活性物質(zhì)，由活化的免疫細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞所分泌，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)的一類小分子多肽，作為細(xì)胞外基質(zhì)間的一種重要的信號傳導(dǎo)介質(zhì)，它們參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、代謝凋亡過程，在創(chuàng)傷修復(fù)和瘢痕形成過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[3]。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1TGFβ1）的作用尤為重要。TGF-β1基因位于第19號染色體長臂上，含7個外顯子和6個內(nèi)含子，是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，在胚胎發(fā)育和組織損傷的修復(fù)和更新中起重要作用，影響傷口愈合過程的所有階段，包括炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)積累。目前普遍認(rèn)為TGF-β1與病理性瘢痕形成有密切聯(lián)系，這一點已被大量實驗所證實[4-5]。

分子生物學(xué)研究表明TGF-β1基因存在著基因變異及基因多態(tài)性，這種基因多態(tài)性與多種疾病存在密切相關(guān)性[6-7]，而與中國漢族人群病理性瘢痕是否相關(guān)，目前國內(nèi)、外鮮見文獻報道。本實驗中，研究對象基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，表明其基因頻率已達到遺傳平衡并具有群體代表性。研究初步結(jié)果提示，TGF-β1基因-509位點C等位基因及CC基因型是中國浙江地區(qū)人群對病理性瘢痕的易感因素?？梢酝茰y，在組織局部分泌TGF-β1機制中，該位點不同基因型可以通過調(diào)節(jié)TGFβ1mRNA的轉(zhuǎn)錄活性的高低，進而影響TGF-β1蛋白表達量的多少。我們的初步研究結(jié)果對病理性瘢痕的預(yù)測診斷及篩選具有較大潛在的臨床意義，然而更大樣本、更多地域、多民族的印證研究尚有待完善。

本實驗采用的聚合酶鏈反應(yīng)-反向點雜交方法是由Saiki RK[8]于1989年首次提出，雖然在原理上與正向斑點雜交相似，但卻巧妙地反其道而用之，即反方向的將各種探針固定在基質(zhì)上，用以檢測受檢的各種標(biāo)記樣品中與探針互補的核酸物質(zhì)的變化。近年來應(yīng)用此法進行β-地中海貧血、囊腫性纖維化等疾病的基因診斷，取得較好效果。該方法分辨率高，技術(shù)簡便、快速、可靠，其檢測結(jié)果與DNA測序符合率高，值得推廣應(yīng)用。

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[8]Saiki RK，Walsh PS，Levenson CH.Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1989，86:6230-6234.

[收稿日期]2008-03-06 [修回日期]2008-06-16

編輯/張惠娟